抗PD-1纳米抗体的筛选及应用制造技术

本发明专利技术公开抗PD‑1纳米抗体的筛选以及应用。并且本发明专利技术还提供了抗PD‑1纳米抗体的决定簇互补区和框架区，编码PD‑1纳米抗体的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了包含纳米抗体文库的构建方法以及抗PD‑1纳米抗体的筛选方法。筛选出来的该抗PD‑1纳米抗体可应用于分子检测，作为治疗多种肿瘤的方法。

【技术实现步骤摘要】
抗PD-1纳米抗体的筛选及应用
本专利技术设计纳米抗体文库的构建以及利用哺乳动物展示技术筛选医用抗PD-1纳米抗体与其应用研究。
技术介绍
PD-1(programmeddeath1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。肿瘤免疫治疗领域研究热点主要集中在抗程序性死亡-1（PD-1）受体等免疫检查点抑制剂上，它和传统的化疗和靶向治疗不同，主要是通过克服患者体内的免疫抑制，重新激活患者自身的免疫细胞来杀伤肿瘤，是一种全新的抗肿瘤治疗理念。肿瘤的免疫逃逸机制与肿瘤微环境之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗早期肿瘤特异性的杀伤性T细胞是有其生物活性的，但随着肿瘤生长后期失去了杀伤的功能。所以肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的杀伤，它不但要在体内激活原有的免疫系统反应，更要维持免疫系统反应的持续时间和反应强度。人体内T细胞的活化采取了两条信号通路的系统，即通过抗原呈递细胞MHC-抗原给细胞提供第一信号外，还需要一系列分子提供第二号，才能使T细胞产生免疫应答。这个双信号通路系统严格调控着机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答。肿瘤细胞通过高表达PD-L1与体内的T细胞表面的PD-1结合，弱化T细胞的杀伤能力，从而躲避T细胞的杀伤。因此，PD-1为一个行之有效的靶点，对其开发出相应的抗体是治疗此类肿瘤的有效手段之一。日前有多家跨国制药公司在研发针对PD-1的单克降抗体，通过阻断PDL1和PD-1之间相互左右，最大限度的提高患者自身对肿的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤。如Merck公司的PD-1单克隆抗体在临床结果中，在非小细胞肺癌、黑素瘤等癌症中都看到了一定的疗效。这表明PD-1抗体对肿有着积极疗效。哺乳动物细胞展示系统为治疗性抗体的产生提供了许多潜在的优势，包括能够在细胞表面显示功能性糖基化IgGs的同时，选择与制造相关的关键特性，如高表达和稳定性。这种技术不仅能够展示全长抗体，还能够利用真核表达系统指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子，并在哺乳细胞中稳定且高水平的表达分泌。因此哺乳细胞展示技术具有其他技术没有的潜在优势。在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区。纳米抗体结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。纳米抗体的可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。纳米抗体的应用优势用于生物医药研发(基因工程药物研发、ADC药物研发)；用于临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法)；用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究等。纳米抗体的独特性质，使其在疾病的诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是，如何构建纳米抗体文库并筛选出相应蛋白的纳米抗体，并用此纳米抗体有效治疗肿瘤。为解决上述技术问题，本专利技术首先构建了CDR1,CDR2,CDR3随机氨基酸的纳米抗体文库。本专利技术第一方面，本专利技术的第一方面，构建并提供了纳米抗体文库；该纳米抗体文库由框架区和决定簇互补区构成；纳米抗体文库的决定簇区CDR1,CDR2,CDR3均有随机氨基酸构成；编码决定簇区的氨基酸的核苷酸均为NNS（N：A/T/C/G；S：C/G）。所述的纳米抗体文库决定簇互补区CDR1由7个随机氨基酸组成，CDR2由8个随机氨基酸组成，CDR3由6-16个随机氨基酸组成。该纳米抗体的框架区FR由FR1,FR2,FR3,FR4组成；其中所述FR1氨基酸序列为表中第1-26位氨基酸；所述FR2氨基酸序列为表中第35-51位氨基酸；所述FR3氨基酸序列为表中第60-97位氨基酸；所述FR4氨基酸序列为表中第104/105/106/107/108/109/110/111/112/113/114/115/116/117/118/119-117/118/119/120/121/122/123/124/125/126/126/128/129/130/131/132位氨基酸。为了使纳米抗体文库在哺乳动物细胞上展示以便筛选，在纳米抗体序列的羧基端加入跨膜域以便锚定在哺乳动物细胞膜上，其氨基酸序列在列表NbLSQE中所示；在纳米抗体文库序列氨基端加入分泌肽Igκ，其氨基酸序列在列表中NbLSQE中所示；纳米抗体文库与其跨膜域之间有柔性linker，其氨基酸为GGGGSGGGS。所述纳米抗体文库的氨基酸序列如表NbLSQE中所示。为了便于纳米抗体文库的筛选，改造CRISPR-V2慢病毒质粒，保留原有EF-1αcore启动子，剔除U6启动子到gRNAscaffold这段核苷酸序列；将纳米抗体文库构建到此慢病毒载体中，所述改造后慢病毒载体如图1所示。为了便于抗PD-1纳米抗体的筛选，所表达的PD-1胞外域重组蛋白在真核细胞中表达，所选用的表达细胞株为HEK-293T。为了便于抗PD-1纳米抗体的筛选，在PD-1胞外域的羧基端加上mFc以便流式分选以及检测，所述mFc序列为表SQE中所示；在mFc的羧基端连接上6个重复组氨酸（HHHHHH）标签以便纯化。本专利技术也应用构建的纳米抗体文库筛选出PD-1的纳米抗体，该纳米抗体包含决定簇互补区和框架区；所述的纳米抗体决定簇互补区由CDR1，CDR2，CDR3组成；所述CDR1氨基酸序列为列表SQE中的第27-34位氨基酸；所述CDR2氨基酸序列为列表SQE中第52-59位氨基酸；所述CDR3氨基酸序列为列表SQE中98-108位氨基酸。所述抗PD-1纳米抗体氨基酸序列表中SQE所示。为了使所述抗PD-1纳米抗体便于纯化与检测，可在序列表中SQE所示的第1-121位氨基酸所示的蛋白质的氨基酸末端连接上6个重复组氨酸（HHHHHH）标签以便纯化。本专利技术还提供了与所述抗PD-1纳米抗体相关的生物材料，B1-B12中任一种：B1编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子B2含有B1所述核酸分子的表达盒；B3含有B1所述核酸分子的重组载体；B4含有B2所述表达盒的重组载体；B5含有B1所述核酸分子的重组微生物；B6含有B2所述表达盒的重组微生物；B7含有B3所述重组载体的重组微生物；B8含有B1所述重组载体的重组微生物；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纳米抗体，包括框架区和决定簇互补区，其特征为：此纳米抗体决定簇互补区由CDR1,CDR2和CDR3构成；此纳米抗体CDR1氨基酸序列为表SQE中27-34位氨基酸；此纳米抗体CDR2氨基酸序列为表SQE中52-59位氨基酸；此纳米抗体CDR3氨基酸序列为表SQE中98-108位氨基酸。/n

【技术特征摘要】
1.纳米抗体，包括框架区和决定簇互补区，其特征为：此纳米抗体决定簇互补区由CDR1,CDR2和CDR3构成；此纳米抗体CDR1氨基酸序列为表SQE中27-34位氨基酸；此纳米抗体CDR2氨基酸序列为表SQE中52-59位氨基酸；此纳米抗体CDR3氨基酸序列为表SQE中98-108位氨基酸。


2.根据权利要求1诉纳米抗体，由所诉的决定簇互补区和框架区所构成。


3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其氨基酸序列如表SQE所示。


4.与权利要求1或2或3所述纳米抗体相关的生物产品，为B1编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子；B2含有B1所述核酸分子的重组载体。


5.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：仝爱平，魏恒，张宗梁，王跃龙，杨慧，周良学，郭刚，徐建国，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51