【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于真核基因组修饰的改造的CAS9系统相关申请的交叉引用本申请要求2018年2月15日提交的美国临时申请序列号62/631,304、以及于2018年8月21日提交的美国临时申请序列号62/720,525的权益，所述美国临时申请各自的公开内容在此整体引入作为参考。序列表本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式电子提交，并且在此整体引入作为参考。所述ASCII副本于2019年2月12日创建，命名为P18_023PCT_SL.txt，且大小为370,305字节。领域本公开内容涉及改造的Cas9系统，编码所述系统的核酸，以及使用所述系统用于基因组修饰的方法。背景细菌2类成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)CRISPR/Cas系统作为基因组编辑工具的最近开发，已对改造用于真核基因组修饰的位点特异性内切核酸酶提供了前所未有的容易和简单性。然而，因为每种CRISPR/Cas系统需要特异性前间隔序列邻近基序(PAM)用于靶DNA结合，所以每种系统局限于某些基因组位点。尽管目前最广...
【技术保护点】
1.一种系统，其包含改造的Cas9蛋白和改造的引导RNA，其中所述改造的引导RNA设计为与所述改造的Cas9蛋白复合，并且所述改造的引导RNA包含设计为与双链序列的靶序列杂交的5'引导序列，其中所述靶序列对于前间隔序列邻近基序（PAM）为5'，并且所述PAM具有如表A中列出的序列。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
【国外来华专利技术】20180215 US 62/631304;20180821 US 62/7205251.一种系统，其包含改造的Cas9蛋白和改造的引导RNA，其中所述改造的引导RNA设计为与所述改造的Cas9蛋白复合，并且所述改造的引导RNA包含设计为与双链序列的靶序列杂交的5'引导序列，其中所述靶序列对于前间隔序列邻近基序（PAM）为5'，并且所述PAM具有如表A中列出的序列。
2.权利要求1的系统，其中所述改造的Cas9蛋白包含相对于其野生型配对物的至少一种修饰。
3.权利要求2的系统，其中所述至少一种修饰包含至少一个异源结构域的添加。
4.权利要求2或3的系统，其中所述至少一个异源结构域是核定位信号、细胞穿透结构域、标记物结构域、染色质调节基序、表观遗传修饰结构域、转录调节结构域、RNA适体结合结构域或其组合。
5.权利要求2的系统，其中所述至少一种修饰包含一个或多个氨基酸的取代、一个或多个氨基酸的插入、一个或多个氨基酸的缺失或其组合。
6.权利要求5的系统，其中所述至少一种修饰在RuvC结构域、HNH结构域、REC结构域、PAM相互作用结构域或其组合内。
7.权利要求1至6中任一项的系统，其中所述改造的Cas9蛋白是核酸酶并且切割双链序列的两条链，是切口酶并且切割双链序列的一条链，或者不具有核酸酶或切口酶活性。
8.权利要求1至7中任一项的系统，其中所述改造的引导RNA是单个分子。
9.权利要求1至8中任一项的系统，其中所述改造的引导RNA序列进行优化，以促进在所述改造的引导RNA内的碱基配对，使所述改造的引导RNA内的碱基配对降到最低，增加所述改造的引导RNA的稳定性，促进所述改造的引导RNA在真核细胞中的转录或其组合。
10.权利要求1至9中任一项的系统，其中所述改造的Cas9蛋白来自斯密氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、Parasutterellaexcrementihominis、犬支原体(Mycoplasmacanis)、鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)、Akkermansiaglycaniphila、嗜粘蛋白艾克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)、北原酒球菌(Oenococcuskitaharae)、Bifidobacteriumbombi、解纤维素热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)、橙皮苷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillushesperidum)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinellasuccinogenes)、Nitratifractorsalsuginis、蒲桃雷尔氏菌(Ralstoniasyzygii)或白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)。
11.权利要求1至10中任一项的系统，其中所述改造的Cas9蛋白来自斯密氏芽孢杆菌，并且其识别的PAM序列是5’-NNNNCAAA-3’，所述改造的Cas9蛋白来自鼠李糖乳杆菌，并且其识别的PAM序列是5’-NGAAA-3’，所述改造的Cas9蛋白来自Parasutterellaexcrementihominis，并且其识别的PAM序列是5'-NGG-3'，所述改造的Cas9蛋白来自犬支原体，并且其识别的PAM序列是5'-NNGG-3'，所述改造的Cas9蛋白来自鸡败血支原体，并且其识别的PAM序列是5’-NNAAT-3’，所述改造的Cas9蛋白来自Akkermansiaglycaniphila，并且其识别的PAM序列是5’-NNNRTA-3’，所述改造的Cas9蛋白来自嗜粘蛋白艾克曼氏菌，并且其识别的PAM序列是5’-MMACCA-3’，所述改造的Cas9蛋白来自北原酒球菌，并且其识别的PAM序列是5'-NNG-3'，所述改造的Cas9蛋白来自Bifidobacteriumbombi，并且其识别的PAM序列是5’-NNNNGRY-3’，所述改造的Cas9蛋白来自解纤维素热酸菌，并且其识别的PAM序列是5'-NGG-3'，所述改造的Cas9蛋白来自橙皮苷脂环酸芽孢杆菌，并且其识别的PAM序列是5'-NGG-3'，所述改造的Cas9蛋白来自产琥珀酸沃林氏菌，并且其识别的PAM序列是5'-NGG-3'，所述改造的Cas9蛋白来自Nitratifractorsalsuginis，并且其识别的PAM序列是5’-NRGNK-3’，所述改造的Cas9蛋白来自蒲桃雷尔氏菌，并且其识别的PAM序列是5’-GGGRG-3’，或所述改造的Cas9蛋白来自白喉棒状杆菌，并且其识别的PAM序列是5’-NNAMMMC-3’，其中K是G或T；M是A或C；N是A、C、G或T；R是A或G；且Y是C或T。
12.权利要求1至11中任一项的系统，其中所述改造的Cas9蛋白具有的氨基酸序列与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、117、118、119、120、121、122、123或124具有至少约90%的序列同一性。
13.权利要求1至12中任一项的系统，其中所述改造的Cas9蛋白具有如SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、117、118、119、120、121、122、123或124中所示的氨基酸序列。
14.编码权利要求1至13中任一项的系统的多种核酸，所述多种核酸包含编码所述改造的Cas9蛋白的至少一种核酸、以及编码所述改造的引导RNA的至少一种核酸。
15.权利要求14的多种核酸，其中编码所述改造的Cas9蛋白的所述至少一种核酸是RNA。
16.权利要求14的多种核酸，其中编码所述改造的Cas9蛋白的所述至少一种核酸是DNA。
17.权利要求14至16中任一项的多种核酸，其中编码所述改造的Cas9蛋白的所述至少一种核酸进行密码子优化，用于在真核细胞中表达。
技术研发人员：T西贝克，陈福强，G戴维斯，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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