【技术实现步骤摘要】
一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法
本专利技术属于蛋白质工程
，具体涉及基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，还涉及由该优化设计方法得到的SpCas9的新型突变体，以及作为基因编辑工具的应用。
技术介绍
CRISPR是细菌和古细菌中抵抗外源核酸入侵的免疫系统。近年来，已被人们开发成一种特异性切割DNA片段的基因编辑工具[1]。目前人们最常使用的是II型CRISPR系统中的化脓性链球菌Cas9（SpCas9）[2]。但是，SpCas9存在PAM（protospaceradjacentmotifs）识别范围有限以及基因编辑时易脱靶的问题，从而使其更广泛应用受到限制[3-5]。因此，只有拓展PAM识别范围和降低脱靶效应，才能使SpCas9技术在基因编辑领域发挥更大的作用。为了达到以上目标，人们已提出多种研究方法：一种是利用细菌选择系统来筛选设计SpCas9，通过该方法获得了PAM识别范围扩大的VQR、EQR和VRER突变体[6]。另一种是基于SpCas9结构指导的改造方法，也获得了高保真突变体eSpCa...
【技术保护点】
1.一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，其特征在于，从能量角度出发，使用Rosetta来优化Cas9蛋白与DNA有相互作用的重要氨基酸，以增强Cas9对DNA的结合力，从而获得PAM兼容性高或脱靶率低的突变体，记该突变体为yCas9，具体步骤为：/n第一步：确定对Cas9特性有重要影响的氨基酸位点；/n从蛋白质数据库中下载蛋白结构，通过分析和比较蛋白的电子密度图，找出对Cas9的PAM识别或者脱靶作用有重要影响的氨基酸位点；xCas9突变的7个定向进化位点：A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I和E1219V，分布在sgRNA-DN...
【技术特征摘要】
1.一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，其特征在于，从能量角度出发，使用Rosetta来优化Cas9蛋白与DNA有相互作用的重要氨基酸，以增强Cas9对DNA的结合力，从而获得PAM兼容性高或脱靶率低的突变体，记该突变体为yCas9，具体步骤为：
第一步：确定对Cas9特性有重要影响的氨基酸位点；
从蛋白质数据库中下载蛋白结构，通过分析和比较蛋白的电子密度图，找出对Cas9的PAM识别或者脱靶作用有重要影响的氨基酸位点；xCas9突变的7个定向进化位点：A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I和E1219V，分布在sgRNA-DNA异源双链体的两侧，这7个氨基酸共同作用，拓展了xCas9的PAM识别范围并降低其脱靶效应；因此，选取这7个位点作为Rosetta优化设计的氨基酸位点；
第二步：Relax能量最小化，选出能量最低的结构作为初始结构；
Relax是Rosetta软件里结构预测中的一个模块；在Rosetta力场中，使用该模块通过多次迭代使结构的氨基酸侧链重排，并且在每轮迭代中不断地调整范德华作用力，以能量最小化的方式搜索该结构的局部最优构象；故采用Relax模块对SpCas9结构（PDBID:4UN3）进行多轮迭代，并根据Rosetta的打分函数，选出能量最低的结构作为初始结构；
第三步：Fixbb优化Protein-DNA相互作用界面；
Fixbb是Rosetta软件里蛋白设计中一个模块；该模块可在固定蛋白主链骨架的同时，使侧链自由旋转，寻找其最佳的位置，并设计最适合该位置的氨基酸；
所以，使用Fixbb模块固定第二步中筛选出的初始结构的主链原子，并对第一步中确定的7个氨基酸位点：262、324、409、480、543、694、1219，进行20种氨基酸组合突变设计，使程序输出10000个排列组合；
第四步：去除重复性结果，筛选突变体；
Fixbb模块输出的结果中，有很多重复的结果；此步骤通过对输出的10000个结果进行序列比对，去除重复的结果，把...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄强，薛冬梅，朱海霞，杜文豪，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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