一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法，优选硫堇‑亚硫酸盐染色，易溶于热水，并有显著的因光异色作用，最大吸收波长(水中)602.5nm，适用于高特异性细胞核DNA定量染色，弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱，特异性不高的缺点。本发明专利技术适用于各类细胞核DNA染色，尤其适用于细胞DNA定量染色分析；可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用，适用性广，商业用途价值高。

【技术实现步骤摘要】
一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法
本专利技术涉及一种细胞DNA定量检测的染色方法，尤其涉及一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。
技术介绍
脱氧核糖核酸(DNA)染色方法有Feulgen法、甲基绿-派洛宁法、吖啶橙荧光法等，其中最经典的是Feulgen法，Feulgen染色由Feulgen和Rossenbeck在1924年发现的一种细胞核内DNA染色技术。该法是一种经典的酶组织化学法。LeageneFeulgenstain原理在于：DNA经弱酸(1mol/LHCl)水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff(无色品红亚硫酸溶液)试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基(醌基是一个具有颜色的发色团)，所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量或倍体成正比。细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA进行特异性染色、仪器测定细胞核内DNA含量或倍体来判断细胞的生理状态和病理改变。DNA定量细胞学在宫颈癌、口腔鳞癌、头颈部肿瘤、颈部淋巴结肿大、乳腺癌、胃癌、肺癌、泌尿系肿瘤、胸腹积液的临床应用及研究中有重大意义。因传统方法中由载玻片承载的组织、细胞经酸解、固定、水洗等操作后，极易出现不同程度的载玻片掉片(即组织、细胞等标本从载玻片上部分或全部脱落缺失的现象)，造成假阴性的情况，直接影响结果的判定甚至降低方法学的准确性。为此，科研人员研发了各类防脱载玻片，例如CN201921220040.1、CN201521113399.0等所设计的防脱载玻片通过提高洁净度、增加黏附层、增设卡槽等手段对液基细胞学、组织染色等出现的掉片现象有大幅改善。然而，由于传统方法染色过程繁琐，极易受组织固定液种类、酸解时间和温度的影响，仅仅通过增强黏附力防止掉片是治标不治本的，防脱载玻片的脱片仍时有发生。方法学中冷、热、酸、碱、醇对于防脱载玻片的影响仍未得到根本解决。因碱性Schiff特异性不高，背景易出现共染现象，影响结果的判定，降低准确性。
技术实现思路
针对上述技术所存在的不足之处，本专利技术提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液，包括：试剂A，包括：硫堇、染色助剂和水；试剂B，选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种；试剂C，包括：亚硫酸盐和超纯水；所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为：5：1：4(V/V/V)。硫堇，带黑绿色闪光针状结晶。易溶于热水，开始是蓝色，后呈紫色，并有显著的因光异色作用。溶于氯仿，微溶于乙醇、乙醚和冷水。最大吸收波长(水中)602.5nm。也是染色剂，如细胞核的染色，类淀粉蛋白、嗜碱性细胞和黏蛋白染色，活体染色。替代Feulgen染色的碱性品红，特异性更高(背景不易出现共染现象)。亚硫酸盐是一种含氧酸盐，白色结晶性粉末，有二氧化硫的气味，可溶于水，也微溶于醇。兼具还原性、氧化性，多表现还原性用途广泛，在空气中易被氧化为硫酸盐。联合碱性硫堇共同作用，特异性定量标记细胞核DNA。优选地，所述试剂A中，按重量份计，包括：硫堇50-150份，染色助剂20-50份，蒸馏水50-250份。优选地，所述试剂B选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种，或者甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的混合物。更优选地，甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的体积比为7：1。优选地，所述试剂C中，按重量份计，包括：亚硫酸盐20-50份和超纯水50-150份。更优选地，所述亚硫酸盐选自偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠中的一种或多种。本专利技术还提供了上述防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法，包括如下步骤：(1)配制试剂A，再加入试剂B，混合均匀；(2)加入试剂C，恒温25-40℃磁力搅拌30-60min，得防掉片细胞DNA定量染色液。优选地，通过以下方法配制试剂A：按重量份称取硫堇劳氏紫粉末，加入烧杯中，用部分蒸馏水冲洗残留试剂，再加入染色助剂，余量用剩余蒸馏水补齐，然后加热沸腾10-30min，冷却至30-50℃，得试剂A。优选地，上述方法还包括将步骤(2)得到的染色液放入棕色瓶中，冷藏，有效期7天。更优选地，每次使用染色液前快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。本专利技术的有益效果如下：染色液优选硫堇-亚硫酸盐染色，易溶于热水，并有显著的因光异色作用，最大吸收波长(水中)602.5nm，适用于高特异性细胞核DNA定量染色，弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱，特异性不高的缺点。本专利技术适用于各类细胞核DNA染色，尤其适用于细胞DNA定量染色分析；可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用，适用性广，商业用途价值高。附图说明图1.传统Feulgen染色实例脱片结果。图2.本专利技术染色实例脱片结果。图3.本专利技术宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之CV值。图4.本专利技术宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之IOD值。图5.本专利技术宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之线性度。具体实施方式为了便于更清楚的理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细的说明。本专利技术中，“室温”可以是22-30℃。可以理解的是，以下实施例中，如未有特殊说明，其采用的材料及方法均通过本领域常规技术手段即可实现。实施例1以配制420ml为例，本实施例的DNA染液配液步骤如下：(1)按重量份计，称取50份的硫堇劳氏紫粉末，加入500ml烧杯中；量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂；量取20份的染色助剂加入烧杯中，余量用200份蒸馏水补齐。加热沸腾30min，冷却至50℃，即制得试剂A。试剂A中，按重量份计，包括：硫堇50份，染色助剂20份，蒸馏水250份。(2)按照体积比5：1向冷却的液体中加入试剂B，混合均匀。本实施例中，试剂B为乙二醇：磷酸＝7：1(V/V)。(3)称取20份的偏重亚硫酸钠充分溶解于150份的蒸馏水中，室温进行，即制得试剂C，向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C，试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4(V/V/V)，再加入蒸馏水至420ml。(4)在液体中加入磁力搅拌转子后，盖好瓶盖，放置于磁力搅拌器上。(5)恒温箱35℃搅拌45min后放入棕色瓶中，贴好标签，冰箱冷藏，有效期7天。(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。实施例2...

【技术保护点】
1.一种防掉片细胞DNA定量染色液，包括：/n试剂A，包括：硫堇、染色助剂和水；/n试剂B，选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种；/n试剂C，包括：亚硫酸盐和超纯水；/n所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4。/n

【技术特征摘要】
1.一种防掉片细胞DNA定量染色液，包括：
试剂A，包括：硫堇、染色助剂和水；
试剂B，选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种；
试剂C，包括：亚硫酸盐和超纯水；
所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4。


2.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述试剂A中，按重量份计，包括：硫堇50-150份，染色助剂20-50份，蒸馏水50-250份。


3.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述试剂B选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种，或者甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的混合物。


4.根据权利要求3所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的体积比为7：1。


5.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述试剂C中，按重量份计，包括：亚硫酸盐20-50份和超纯水50-150份。


6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺权源，刘朝前，谢凯，
申请(专利权)人：湖南品胜生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43