一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，该方法包括以下步骤：S1：溶液的配制；S2：植物种子的固定；S3：植物种子脂质的去除；S4：植物种子中蛋白的去除；S5：透明种子胚的染色；S6：样品包埋与成像；S7：数据分析。该方法实施简单方便，成本低廉；使用此发明专利技术方法后，种子透明度显著提升，染色效果理想，提升了激发光穿透样品的能力的同时，均匀染色后的样品被完整激发，不仅大幅提高了扫描效率，且成像结果十分清晰。此方法的开发十分利于大体积植物种子三维成像及其结构的重构，也为植物种子内部参数计算提供可靠数据。

【技术实现步骤摘要】
一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法
本专利技术属于生物学领域，具体涉及一种能够快速实现对杨树种子透明染色及其三维成像方法的领域。技术背景生命体的物质与能量代谢等生命活动和器官内部形态发生与结构变化之间存在互相依赖的关系。细胞在行使不同功能过程中并不全是细胞自主性行为，而是通过细胞关联和协同作用的结果。因此，多细胞器官通过不同种类细胞间相互作用赋予系统更高阶的功能。此外，细胞与细胞、细胞与组织乃至组织与组织之间的相互交流和互做逐渐成为目前分子细胞生物学的研究热点，在植物生长发育和优良品种改良方面发挥指导作用。种子内部不同组织状态以及各组织内部细胞的排布结构及动态变化与其休眠、萌发和逆境发育等多种生命活动息息相关。近年来，越来越多的研究热点集中于种子内部结构与其相关功能的关联分析。作为植物生长过程的最初阶段，种子在形态结构上表现出十分稳定的遗传特性，为进一步探索不同种子在品种、发育阶段或遗传改造之间的细微差异提供了研究基础。然而，应用现有成像技术(譬如光学、荧光、共聚焦显微镜以及常规切片技术)对于种子体内组织结构和细胞形态分布分析具有很大的局限性，无法快速简便地获取整体种子形态与内部组成的高分辨、高质量和三维尺度等信息。因此，寻找合适的透明技术和成像方法，对种子内部细胞大小、排布与形态等参数进行深入解析，对了解植物种子的生理学特征和发育过程具有重要的指导意义。光片层荧光显微镜(LightSheetFluorescenceMicroscopy,LSFM)是一种利用片层荧光对样品进行光学切片并实现亚细胞水平成像的技术。与传统共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscopy,LSCM)相比，其含有多个激发光光源以及多个成像物镜，具有多视角、成像快速和低光毒性等优点，成为大尺寸活体样本研究的有效工具之一。由于LSFM技术需要片层激发光穿过样品进行成像，因此待测样品需要具有较高的透明度。植物本身及其内部由不同光学性质的各种物质组成。当激发光穿过植物组织时，光的分布和强度分别因为光散射和光吸收而出现不同程度的变宽和衰减，导致成像图案模糊和弱化，尤其是在组织中深层区域。因此，样品组织的透明度的高低决定着LSFM成像质量。组织透明化可使光散射和吸收最小化，从而改善成像深度和对比度，从而提升成像质量。植物样品透明化后的染色是LSFM成像的关键步骤之一，染色不足导致信噪比低，而染色过度则可能阻碍激发光的路径导致部分信号丢失。因此，不同植物样品染色条件的建立决定着最终成像的质量。然而，已报道的透明及染色技术无法满足LSFM对植物种子高质量成像的需求，因此开发一种适用于植物种子的透明染色及其成像方法对于种子结构、功能及其发育研究提供技术支持，也为植物不同组织、器官甚至整体三维成像的应用提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服种子透明度不高以及染色条件不足的问题，开发一种基于LSFM成像技术对植物种子透明、染色及多尺度细胞水平成像的方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种纯化原核表达融合His标签蛋白的方法，包括以下步骤：S1：溶液的配制：(1)标准固定液(FAA)的配制：取37-40％(m/v)的福尔马林(甲醛)、冰醋酸、65％-70％(v/v)酒精和甘油(丙三醇)按5：5：90：5的体积比例倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液。(2)1mg/mLPI(碘化丙啶,PropidiumIodide)溶液的配制：称取5mgPI粉末，溶于5ml蒸馏水中，利用锡纸包好并-20℃储存。(3)4％(w/v)NaOH溶液的配制：称取4gNaOH固体颗粒，溶于100mL蒸馏水中，得到4％(w/v)NaOH溶液。(4)饱和水合氯醛溶液的配制：称取水合氯醛50g，分别加入15mL和10mL的双蒸水和甘油使其溶解，获得饱和的水合氯醛试液。(5)1％过碘酸溶液的配制：称取过碘酸0.5g，加50mL蒸馏水使其溶解，获得1％过碘酸溶液。(6)NaHSO3-HCl混合溶液的配制，称取1g亚硫酸氢钠NaHSO3溶于10mL1mol/L盐酸中，获得NaHSO3-HCl混合溶液。(7)1％低熔点琼脂糖凝胶溶液的配制，称取1g低熔点琼脂糖，加入蒸馏水100mL并加热至沸腾使其溶解，然后分装至1.5mL离心管中，获得1％琼脂糖凝胶。S2：植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有1mL标准固定液的1.5mL离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中在18-20kpa的压力下固定2h，正常大气压力下于4℃储存1d后，再经过70％至100％(v/v)酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本。S3：植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有1mL石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌48h。弃去石油醚后，加入1mL丙酮浸泡6h。弃去丙酮后，加入1mL氯仿浸泡6h，得到去脂质的植物种子。S4：植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理。按照95％-70％-50％(v/v)酒精的顺序依次漂洗，每步20分钟，最后储存于蒸馏水中。在体视镜下将种皮去除并转移至4％(m/v)的NaOH中于60℃萃取72h，每12h更换一次溶液。随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗三次，每次30分钟，然后于60℃下在饱和水合氯醛水溶液中浸泡48h。弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗30min，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚。S5：透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入1mL过碘酸溶液醛化1h后，蒸馏水清洗3次，每次1分钟。加入1mLNaHSO3-HCl溶液和1mLPI溶液共染3h后，弃去染液。最后用蒸馏水清洗样品1h，得到颜色呈粉红色的染色样品。S6：样品包埋与成像：本步骤使用卡尔蔡司LightsheetZ.1MicroscopeSystem对待测样品进行成像。首先打开LightsheetZ.1显微镜、激光开关、计算机及其控制软件ZENblueedition。根据样品尺寸和实验目的更换相应参数的成像物镜。加热1％低熔点琼脂糖至其完全溶解，将待检测样品浸于其中后，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及1％低熔点琼脂糖。此时为获得更好的成像视角，尽量保证样品在毛细管中垂直分布。待1％低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门。然后按下“LocateCapillary”并打开照明灯，通过“OverviewCamera”窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置。最后进行扫描成像，在“SetExposure”选项卡中设置相应激发光及发射光波段，点击“Continuous”按钮进行样品实时荧光预览，调节激光强度、片层光入射角度、曝光时间和分辨率并设置成像区域、Z轴间距、光片层厚度等，然后点击“Snap”成像。待扫描结束后，打开ZENblueedition软件，选择“Process”模块，导入检测结果原始图片并利用其“DualFusion”功能进行图像的双侧荧光最大化融合。使用“ImarisFileConverter”拼接软件进行不同扫描区域原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：/nS1：溶液的配制：配制标准固定液、PI溶液、NaOH溶液、饱和水合氯醛溶液、过碘酸溶液、NaHSO3-HCl混合溶液、低熔点琼脂糖凝胶溶液；/nS2：植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有标准固定液的离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中固定，再经过酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本；/nS3：植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌，弃去石油醚后，加入丙酮浸泡，弃去丙酮后，加入氯仿浸泡，得到去脂质的植物种子；/nS4：植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理；在体视镜下将种皮去除并转移至NaOH溶液中萃取；随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗；然后在饱和水合氯醛水溶液中浸泡；弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚；/nS5：透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入过碘酸溶液醛化后，采用蒸馏水清洗；加入NaHSO3-HCl溶液和PI溶液共染后，弃去染液；最后用蒸馏水清洗样品；得到颜色呈粉红色的染色样品；/nS6：样品包埋与成像：本步骤使用光片层荧光显微镜对待测样品进行成像；首先打开所述显微镜、激光开关、计算机及其控制软件；将加热低熔点琼脂糖至其完全溶解，将待检测样品浸于其中，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及低熔点琼脂糖；待低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门；然后调整所述显微镜使得窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置；最后进行扫描成像，待扫描结束后，通过拼接软件进行不同扫描区域原始图像的拼接，得到二维荧光图像；/nS7：数据分析：利用ImageJ软件对单张二维图像进行细胞参数测量，并利用测量结果对细胞参数进行统计分析；利用Imaris软件对成像后植物胚结构的荧光二维图像进行三维重构及数据，最终得到一套完整的包含原始种子所有三维信息的立体模型。/n...

【技术特征摘要】
1.一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：
S1：溶液的配制：配制标准固定液、PI溶液、NaOH溶液、饱和水合氯醛溶液、过碘酸溶液、NaHSO3-HCl混合溶液、低熔点琼脂糖凝胶溶液；
S2：植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有标准固定液的离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中固定，再经过酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本；
S3：植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌，弃去石油醚后，加入丙酮浸泡，弃去丙酮后，加入氯仿浸泡，得到去脂质的植物种子；
S4：植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理；在体视镜下将种皮去除并转移至NaOH溶液中萃取；随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗；然后在饱和水合氯醛水溶液中浸泡；弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚；
S5：透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入过碘酸溶液醛化后，采用蒸馏水清洗；加入NaHSO3-HCl溶液和PI溶液共染后，弃去染液；最后用蒸馏水清洗样品；得到颜色呈粉红色的染色样品；
S6：样品包埋与成像：本步骤使用光片层荧光显微镜对待测样品进行成像；首先打开所述显微镜、激光开关、计算机及其控制软件；将加热低熔点琼脂糖至其完全溶解，将待检测样品浸于其中，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及低熔点琼脂糖；待低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门；然后调整所述显微镜使得窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置；最后进行扫描成像，待扫描结束后，通过拼接软件进行不同扫描区域原始图像的拼接，得到二维荧光图像；
S7：数据分析：利用ImageJ软件对单张二维图像进行细胞参数测量，并利用测量结果对细胞参数进行统计分析；利用Imaris软件对成像后植物胚结构的荧光二维图像进行三维重构及数据，最终得到一套完整的包含原始种子所有三维信息的立体模型。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准固定液的配制：取37-40％(m/v)的福尔马林、冰醋酸、65％-70％(v/v)乙醇和甘油按5：5：90：5的体积比例倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液；所述PI溶液的配制：称取5mgPI粉末，溶于5ml蒸馏水中，利用锡纸包好并-20℃储存；所述NaOH溶液的配制：称取4gNaOH固体颗粒，溶于100mL蒸馏水中，得到4％(w/v)NaOH溶液；所述饱和水合氯醛溶液的配制：称...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，张曦，胡子健，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11