一种动物组织透明化方法技术

本发明专利技术提供了一种动物组织透明化方法，属于动物组织观察技术领域，所述方法，包括以下步骤：1)麻醉动物、向动物心脏依次灌注心脏灌注液和组织固定液；然后解剖并分离动物组织；2)将骨骼组织置于脱钙溶液中脱钙5～12d获得脱钙后的骨骼组织；在所述脱钙过程中每1～3天进行一次换液；3)将脱钙后的骨骼组织和软组织分别置于脱色液中进行脱色获得脱色后的组织；4)将所述脱色后的组织置于脱脂液中进行梯度脱脂后，置于脱水液中脱水获得脱水组织；5)将所述脱水组织置于透明液中进行透明获得透明组织。通过本发明专利技术所述方法能够实现组织大视野、多角度、深层次的观察。

【技术实现步骤摘要】
一种动物组织透明化方法
本专利技术属于动物组织观察
，尤其涉及一种动物组织透明化方法。
技术介绍
针对组织的观察，是医疗和科研中最为常见的观察方法。传统组织学手段主要有大体解剖和组织切片两种方式。大体解剖可以观察动物体内诸器官的位置、形态、结构和毗邻关系，但无法观察器官内的显微结构。组织切片分为石蜡包埋切片、冰冻切片等。其虽然可以通过显微镜获取器官内有关细胞或亚细胞结构的细节信息，但也有其局限之处：第一，在组织切片过程中，破坏了器官的完整性；第二，破坏了特殊类型细胞显微结构的连续性。在过去的数十年中，随着影像学技术的飞速发展，CT、MRI以及PET等影像手段不仅拥有出色的组织成像深度，还具备越来越好的细节分辨能力，但这些影像学设备最高的分辨率目前也无法使成像效果达到细胞水平；传统的显微成像虽然可以进行显微观察，但即便是成像深度最深的双光子显微镜对组织的观测深度也只有几百微米，难以完成较厚组织或完整器官成像。而组织透明技术则弥补了传统组织学研究方法中的一些缺陷，在不破坏器官完整性的前提下，观察其内在显微结构，避免了切片间的信息丢失，真正实现了细胞等结构的三维成像，对组织学发展具有革命性意义。当前使用的组织透明化技术多为有机溶剂或水溶性溶剂的透明化方法，有机溶剂透明后，成像较为困难，会对镜头产生腐蚀，水溶剂透明化时间较长，组织变形较大，可能对后期的蛋白观察存在一定的影响。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种动物组织透明化方法，所述方法能够将不同种类的动物组织完全透明化，本专利技术将有机溶剂透明化和水溶性溶剂透明化进行结合，缩短了透明化的时间，又能更好的将组织展现在高倍镜下；能够实现组织大视野、多角度、深层次的观察。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种动物组织透明化方法，包括以下步骤：1)麻醉动物、向动物心脏依次灌注心脏灌注液和组织固定液；然后解剖并分离动物组织；2)将骨骼组织置于脱钙溶液中脱钙5～12天获得脱钙后的骨骼组织；在所述脱钙过程中每1～3天进行一次换液；3)将脱钙后的骨骼组织和软组织分别置于脱色液中进行脱色获得脱色后的组织；4)将所述脱色后的组织置于脱脂液中进行梯度脱脂后，置于脱水液中脱水获得脱水组织；5)将所述脱水组织置于透明液中进行透明获得透明组织。优选的，所述动物包括小鼠。优选的，所述软组织包括脏器组织和视网膜。优选的，所述组织还包括胚胎，当所述组织为胚胎时，所述胚胎进行1～3天脱钙处理。优选的，步骤1)中所述的心脏灌注液为0.9％的生理盐水注射液或0.04～0.06M的EDTA溶液；所述组织固定液为3.5％～4.5％的多聚甲醛PBS溶液；所述心脏灌注液和组织固定液的灌注体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。优选的，步骤2)中所述脱钙液为0.45～0.55M的EDTA溶液，所述脱钙液的pH值为6.4～6.6。优选的，步骤3)中所述脱色液体积分数为28％～32％的四羟丙基乙二胺溶液；所述脱色的温度为36～38℃，所述脱色的时间为8～96h。优选的，步骤4)中所述梯度脱脂包括依次进行的第一脱脂、第二脱脂和第三脱脂；所述脱脂液包括第一脱脂液、第二脱脂液和第三脱脂液；所述第一脱脂液为体积分数28％～32％的叔丁醇溶液；所述第二脱脂液为体积分数58％～62％的叔丁醇溶液；所述第三脱脂液为体积分数73％～77％的叔丁醇溶液；所述第一脱脂的时间为4～7h，所述第二脱脂的时间为7～9h，所述第三脱脂的时间为30～35h。优选的，步骤4)中所述脱水液包括以下体积百分含量的组分：73％～77％的叔丁醇溶液、18％～22％的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和4％～6％的四羟丙基乙二胺溶液；所述脱水的时间为50～100h。优选的，所述透明液包括以下体积百分含量的组分：76％～80％苯甲酸苄酯、18％～22％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和1％～3％的四羟丙基乙二胺溶液；所述透明的时间为5～7h。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的动物组织透明化方法通过麻醉和固定动物组织，然后对动物组织进行脱钙、脱色、脱脂和透明，能够使不同的动物组织完全透明化，通过所述方法能够实现组织大视野、多角度、深层次的观察。本专利技术所述方法适用于软组织及硬组织；所述方法的透明化时间相比常规的透明化方法均有缩短；本专利技术所述方法用的透明化的试剂毒性小，安全性高；所述透明的过程便于操作，无需电流、电泳等技术的干预；所述方法组织透明后的成像，可以使用双光子共聚焦显微镜观察，也可以使用Lightsheet光片显微镜进行观察。附图说明图1为小鼠肝脏透明前后的对比照片，其中左图为透明前，右图为透明后；图2为小鼠骨骼透明前后的对比照片，其中左图为透明前，右图为透明后；图3为小鼠肝胚胎明前后的对比照片，其中左图为透明前，右图为透明后；图4为小鼠肾脏透明前后的对比照片，其中左图为透明前，右图为透明后；图5为小鼠视网膜透明前后的对比照片，其中左图为透明前，右图为透明后；图6为小鼠心脏透明前后的对比照片，其中左图为透明前，右图为透明后；图7为透明前后视网膜血管荧光标记对比照片，左图为透明前，右图为透明后；图8为透明后胚胎血管荧光标记照片；图9为透明后骨骼血管荧光标记照片；图10为透明后心脏血管荧光标记照片。具体实施方式本专利技术提供了一种动物组织透明化方法，包括以下步骤：1)麻醉动物、向动物心脏依次灌注心脏灌注液和组织固定液；然后解剖并分离动物组织；2)将骨骼组织置于脱钙溶液中脱钙5～12天获得脱钙后的骨骼组织；在所述脱钙过程中每1～3天进行一次换液；3)将脱钙后的骨骼组织和软组织分别置于脱色液中进行脱色获得脱色后的组织；4)将所述脱色后的组织置于脱脂液中进行梯度脱脂后，置于脱水液中脱水获得脱水组织；5)将所述脱水组织置于透明液中进行透明获得透明组织。在本专利技术中，首先麻醉动物。在本专利技术中，所述动物优选为小鼠；所述麻醉优选为腹腔注射麻药，所述麻药优选的包括质量分数为0.1～0.3％的戊巴比妥或80～100mg/kg氯氨酮，更优选的包括质量分数为0.3％的戊巴比妥或90mg/kg氯氨酮。在本专利技术中，所述麻药的注射剂量优选为0.3％的戊巴比妥；本专利技术优选的通过捏反应判断小鼠麻醉程度，确保小鼠无任何抵抗反应。在本专利技术中，麻醉动物后，向动物心脏依次灌注心脏灌注液和组织固定液。在本专利技术中，所述的心脏灌注液优选为0.9％的注射用无菌生理盐水注射液或0.04～0.06M的EDTA溶液；所述EDTA溶液的浓度更优选为0.05M。在本专利技术中，所述组织固定液优选为3.5％～4.5％的多聚甲醛PBS溶液，更优选为4％的多聚甲醛PBS溶液，在本专利技术具体实施过程中，优选的将多聚甲醛溶解于1×PBS中进行配制。在本专利技术中，所述心脏灌注液和组织固定液的灌注体积比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，更优选为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物组织透明化方法，包括以下步骤：/n1)麻醉动物、向动物心脏依次灌注心脏灌注液和组织固定液；然后解剖并分离动物组织；/n2)将骨骼组织置于脱钙溶液中脱钙5～12d获得脱钙后的骨骼组织；在所述脱钙过程中每1～3天进行一次换液；/n3)将脱钙后的骨骼组织和软组织分别置于脱色液中进行脱色获得脱色后的组织；/n4)将所述脱色后的组织置于脱脂液中进行梯度脱脂后，置于脱水液中脱水获得脱水组织；/n5)将所述脱水组织置于透明液中进行透明获得透明组织。/n

【技术特征摘要】
1.一种动物组织透明化方法，包括以下步骤：
1)麻醉动物、向动物心脏依次灌注心脏灌注液和组织固定液；然后解剖并分离动物组织；
2)将骨骼组织置于脱钙溶液中脱钙5～12d获得脱钙后的骨骼组织；在所述脱钙过程中每1～3天进行一次换液；
3)将脱钙后的骨骼组织和软组织分别置于脱色液中进行脱色获得脱色后的组织；
4)将所述脱色后的组织置于脱脂液中进行梯度脱脂后，置于脱水液中脱水获得脱水组织；
5)将所述脱水组织置于透明液中进行透明获得透明组织。


2.根据权利要求1所述的动物组织透明化方法，其特征在于，所述动物包括小鼠。


3.根据权利要求1或2所述的动物组织透明化方法，其特征在于，所述软组织包括脏器组织和视网膜。


4.根据权利要求1所述的动物组织透明化方法，其特征在于，所述组织还包括胚胎，当所述组织为胚胎时，所述胚胎进行1～3d脱钙处理。


5.根据权利要求1所述的动物组织透明化方法，其特征在于，步骤1)中所述的心脏灌注液为0.9％的无菌生理盐水注射液或0.04～0.06M的EDTA溶液；所述组织固定液为3.5％～4.5％的多聚甲醛PBS溶液；所述心脏灌注液和组织固定液的灌注体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。


6.根据权利要求1或4所述的动物组织透明化方法，其特征在于，步骤2)中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏明峰，相珊，郑志娟，阚东方，李静，李运伦，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东;37