蛋白质电泳染色液、试剂盒及染色方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白质电泳染色液，该染色液中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。本发明专利技术还公开了用该染色液进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条带染色的方法。本发明专利技术通过改进蛋白质电泳染色液的配方，提升了蛋白质电泳条带染色的效果，加快了染色、脱色速度，同时确保了染色液对人体的安全性，特别适合用于SDS‑PAGE或非变性PAGE等蛋白凝胶的无污染、快速、高灵敏染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质电泳染色液、试剂盒及染色方法
本专利技术涉及生物领域，特别是涉及蛋白质电泳，更具体地说，是涉及蛋白质电泳条带染色液的配方，及使用该染色液进行染色、脱色的方法。
技术介绍
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是目前分析蛋白质组分和检测的最基本方法，可以分离蛋白并测定蛋白质的相对分子量和蛋白纯度，还可以用于蛋白的分离纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色方法很多，常用到的有氨基黑染色、考马斯亮蓝染色、银染色和荧光染色等方法。其中，考马斯亮蓝染色由于比氨基黑染色灵敏度更高，比银染色操作更简便，并且重复性高，具有非常好的质谱兼容性，是目前最为常用的蛋白凝胶电泳染色方法。其原理是考马斯亮蓝可与蛋白质形成较强的非共价复合物。考马斯亮蓝分子上的芳香苯环与蛋白质的疏水区结合，同时考马斯亮蓝分子上的亚硫酸基团与蛋白质的正电荷结合，在可见光下显蓝色。根据考马斯亮蓝的光谱特性还可进一步估算溶液中蛋白质的含量，在595nm的最大吸收波长下测量溶液的光学吸光度，该方法具有高灵敏度，最高可辨别5μg的蛋白质。考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。根据科学出版社2001年出版的《蛋白质技术手册》，经典的R250考马斯亮蓝配方是：每升考马斯亮蓝染液含考马斯亮蓝R-2501.0g、甲醇450ml、蒸馏水450ml、冰醋酸100ml；每升脱色液含甲醇100ml、冰醋酸100ml、蒸馏水800ml。考马斯亮蓝染色的常规方法是：1)将胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝的容器内，或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落；2)对于0.75mm的凝胶，可在据床上缓慢震荡5-10min；对于1.5mm的凝胶，则为10-20min；3)弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次；4)加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。该方法的缺点是灵敏度不高，检测下限仅为200-500ng，背景较高，而且染色液中含有对人体有害的甲醇、冰醋酸等。目前市售的考马斯亮蓝染色液存在的主要问题是染色和脱色时间长、灵敏度低（检测下限仅为200-500ng），且含有剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸。目前也有针对经典考马斯亮蓝配方进行的改进，如中国专利技术专利CN104004382B，采用了加入可溶性淀粉的方案，可以在20min内完成染色，然而淀粉在溶液中保质期短，并且该可溶性淀粉的制作最长需要7天，步骤繁琐，因此限制了这一技术的使用。因此，蛋白染色领域中需要一种成本低、制备简便、环保无毒害、储存时间长、重复性高且具有非常好的质谱兼容性的染色配方。除此之外，还需要解决染色、脱色时间过长的问题，现行的配方染色时间通常要达到30min以上才能达到较好的实验结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种蛋白质电泳染色液，它配方简单，染色效果好，染、脱色速度快，且无毒无害，成本低。为解决上述技术问题，本专利技术的蛋白质电泳染色液，配方中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。所述考马斯亮蓝可以使用考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250中的一种或两种。每升该蛋白质电泳染色液中，所述考马斯亮蓝G-250的用量优选为30～500mg/L，进一步优选为250mg/L；所述考马斯亮蓝R-250的用量优选为200～500mg/L，进一步优选为300mg/L；所述浓盐酸的用量优选为3～20ml/L，进一步优选为15ml/L。较佳的，所述染色液的配方中还可以进一步添加甘油、香精、海藻糖、吐温20中的一种或多种。甘油无色、透明、无臭、粘稠液体，具有吸湿性，在高浓度下能有效降低凝胶在加热过程中发生膨胀、蜷曲，增强染色效果，降低所需染色时间。香精能改善染色液的气味。海藻糖具有极强的耐热性和强大的保湿能力，能防止过热引起的凝胶溶解、蛋白条带扩散，同时能大大延长染色后凝胶的保存时间。吐温20能增大染液极性，使染液能更好地进入凝胶内部，从而有效减少染色时间。每升该蛋白质电泳染色液中，所述甘油的用量优选为80～120ml/L，进一步优选为100ml/L；所述香精的用量优选为1ml/L；所述海藻糖的用量优选为10～30g/L，进一步优选为20g/L；所述吐温20的用量优选为0.1～3g/L，进一步优选为1g/L。上述蛋白质电泳染色液的酸度可以是4.5～16，优选为14。本专利技术要解决的技术问题之二是提供用上述染色液进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条带染色的方法，该方法包括以下步骤：1）用水振荡清洗蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后所得到的凝胶；2）用热水振荡清洗步骤1）所得凝胶；3）用水清洗步骤2）所得凝胶；4）向步骤3）所得凝胶中加入所述染色液，加热，但不煮沸，进行振荡染色；5）倒掉染色液，加水，振荡脱色。上述步骤1）和步骤3）中的清洗步骤，优选用去离子水（用量一般为50～100ml）振荡清洗凝胶1～2min，倒掉清洗的水，重复两次。上述步骤2)中，热水振荡清洗的目的在于溶解凝胶中的SDS，降低其对蛋白条带染色的影响。可以将凝胶和去离子水（用量一般为50～100ml）一起用微波炉加热至接近沸腾，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗2～5min。上述步骤4)中，优选为将清洗的凝胶浸没在本专利技术的蛋白质电泳染色液（用量一般为30～50ml）中，加热所述染色液1～2min至接近沸腾（但避免煮沸），然后在摇床上振荡染色5～15min。高温可以加速蛋白条带的着色，使凝胶染色在较短的时间内完成。加热方式优选为微波炉加热，微波炉腔内能够产生2.4GHZ的高频电磁场，带动水分子及相邻分子剧烈运动，从而加速考马斯亮蓝分子穿透凝胶，与凝胶中的蛋白快速结合。同时微波炉能够穿透水溶液5cm以上，不会因为受热不均匀产生凝胶膨胀或卷缩的现象。上述步骤5）中，优选为加入去离子水（用量一般为50～100ml），在摇床上振荡脱色5～10min，倒掉脱色液，重复3次。本专利技术要解决的技术问题之三是提供包含有上述染色液的蛋白质电泳染色试剂盒。本专利技术要解决的技术问题之四是提供上述染色液的用途。该蛋白质电泳染色液可以应用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白凝胶的染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。与传统的蛋白质电泳染色液相比，本专利技术的蛋白质电泳染色液及染色方法，具有以下优点和有益效果：1.环保。传统染色液染色、脱色时间长，长时间泡水会导致凝胶中蛋白扩散，需要使用乙酸、甲醇来固定蛋白；本专利技术的染色液染色速度快，蛋白扩散不明显，不需要使用乙酸、甲醇来固定蛋白。另外，使用传统染色液，由于染料用量大，在脱色时，需要使用乙酸、甲醇或乙醇等有毒有害溶剂帮助溶解染料来加快脱色；而使用本专利技术的染色液，由于染料用量少，背景染色低，在脱色时，不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质电泳染色液，其特征在于，所述染色液中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质电泳染色液，其特征在于，所述染色液中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。


2.根据权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述考马斯亮蓝包括考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250中的一种或两种。


3.根据权利要求2所述的染色液，其特征在于，所述染色液中，所述考马斯亮蓝G-250的含量为30～500mg/L，所述考马斯亮蓝R-250的含量为200～500mg/L，所述浓盐酸的含量为3～20ml/L。


4.根据权利要求3所述的染色液，其特征在于，所述考马斯亮蓝G-250的含量为250mg/L，所述考马斯亮蓝R-250的含量为300mg/L，所述浓盐酸的含量为15ml/L。


5.根据权利要求1-4任一项所述的染色液，其特征在于，所述染色液中还包含有甘油、香精、海藻糖、吐温20中的一种或多种。


6.根据权利要求5所述的染色液，其特征在于，所述染色液中，所述甘油的含量为80～120ml/L，所述香精的含量为1ml/L，所述海藻糖的含量为10～30g/L，所述吐温20的含量为0.1～3g/L。


7.根据权利要求6所述的染色液，其特征在于，所述甘油的含量为100ml/L，所述海藻糖的含量为20g/L，所述吐温20的含量为1g/L。


8.根据权利要求1-7任一项所述的染色液，其特征在于，所述染色液的酸度为4.5～16。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦振泉，朱佳威，任杭洁，章丹丹，
申请(专利权)人：浙江玉安康瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33