一种测定萝芙木属植物中利血平（ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ）含量的高效液相色谱方法，特征在于：（１）色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂；（２）流动相为乙腈、甲醇、０．０１％三乙胺水溶液组成的混合溶剂，其组成的体积比例为乙腈４５％～３５％、甲醇１０％～２５％、三乙胺水溶液４５％～４０％；（３）检测波长２６８ｎｍ，柱温４０℃，流速１ｍｌ／ｍｉｎ，进样体积２０ｕｌ。本发明专利技术经过系统的比较研究，首次建立了测定萝芙木属植物中利血平含量的高效液相色谱方法，具有分离效果好，测定准确，灵敏高，专属性强、分析简便快速等技术特点，对准确掌握品种选育、栽培种植优化、提取加工等过程中有效成分利血平的变化，有直接的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种色谱分析方法，具体要求保护的是一种测定萝芙木属植物中有效成分利血平(reserpine)含量的高效液相色谱方法。
技术介绍
利血平是从夹竹桃科萝芙木属(Rauvolfia)植物的根中提取的，具有降血压作用的天然药物，主要制剂有“利血平片”、“利血平注射液”、“复方降压片”等，利血平的结构式如下 rserpine利血平由于结构复杂，化学合成成本高，利血平目前依靠从萝芙木属植物中提取，资源以云南萝芙木R.yunnanensis、催吐萝芙木R.vomitoria为主。由于多年采挖导致资源枯竭，人工种植正在兴起。对萝芙木中利血平的含量分析研究很少，有报道用纸色谱电泳或纤维素色谱分离利血平色带后用分光光度法测定含量，操作烦琐，误差大。建立萝芙木中利血平的先进分析方法，以准确掌握品种选育、栽培种植、提取加工等过程中有效成分利血平的变化，是萝芙木产业开发的关键性技术。
技术实现思路
为准确测定并控制萝芙木类原料中利血平的含量，本专利技术首次提供一种。通过以下技术方法实现(1)色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂；(2)流动相为乙腈、甲醇、0.01％三乙胺水溶液组成的混合溶剂，其组成的体积比例为乙腈45％～35％、甲醇10％～25％、三乙胺水溶液45％～40％；(3)检测波长268nm，柱温40℃，流速1ml/min，进样体积20ul。1、色谱柱的选用考虑到应用的普遍性，选用HPLC测定最常用的碳十八烷基键合硅胶柱。比较了Phenomenex公司Luna C-18柱、Merck公司STARRP-18柱、Agilent公司XDB-C18柱、大连依利特公司C-18柱、江苏汉邦公司C-18柱等，均有较好分离效果。2、检测波长确定取利血平标样用甲醇、HPLC流动相溶解后测定紫外光谱(图3、图4)，具有一致的紫外吸收曲线，有三个主要吸收带。其中218nm的吸收最大但接近末端吸收区域，292nm是肩峰，均不利于测定；268nm处的吸收大且吸收峰较平坦，故检测波长选用268nm。图3是利血平标样在HPLC流动相中的紫外吸收光谱图。图4是利血平标样在甲醇中的紫外吸收光谱图。3、流动相的选用利血平结构复杂，选择适当的流动相以得到良好的分离效果是分析方法的关键。我们选择甲醇-水、乙腈-水等流动相系统对比筛选，均无很好分离效果。根据峰型变化趋势，将流动相调整为甲醇-乙腈-三乙胺水溶液混合溶剂，具有较好的分离效果，部分试验结果见表3。表3流动相对比筛选试验的部分数据 结果表明，以乙腈、甲醇、0.01％三乙胺水溶液组成的混合溶剂最佳；此混合溶剂的组成体积比例在乙腈45％～35％、甲醇10％～25％、三乙胺水溶液45％～40％之间时，均有较好的分离效果，最佳流动相组成为乙腈-甲醇-0.01％三乙胺(45-10-45)。4、其它测定条件按照一般经验，流动相流速选用1ml/min；色谱柱温度选用40℃；进样体积20ul。在上述研究确定的条件下，利血平吸收峰保留时间约21分钟；萝芙木样品图谱中各成分吸收峰可在40分钟内全部流出色谱柱。利血平标样吸收峰拖尾因子为1.05，理论塔板数大于10000，最低检测限为0.8ng(S/N＝3)。萝芙木药材样品测定图谱中利血平吸收峰拖尾因子为1.04，理论塔板数大于8800，峰分离度大于1.5，符合HPLC测定方法要求。利血平标样、萝芙木药材样品的HPLC图谱见附图1、2。四附图说明图1是本专利技术中利血平标样的HPLC色谱图。图2是本专利技术中萝芙木药材样品的HPLC色谱图。五、方法学考查利血平标样连续进样6次，保留时间和峰面积RSD分别为0.99％、1.71％，精密度良好。利血平标样用流动相溶解制成75ug/ml溶液，分别于0h、2h、4h、8h、24h、48h测定，峰面积RSD＝1.64％，说明利血平标样溶液至少在48小时内是稳定的，可用于含量测定。按照药材样品的提取方法制成供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、24h、48h取样测定，其峰面积RSD＝1.94％，说明萝芙木药材样品溶液至少在48小时内是稳定的，可用于含量测定。精密称取利血平标样，用流动相溶解并定容至25ml棕色容量瓶中，制成0.16mg/ml的储备液。分别精密吸取上述溶液0.05ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、7ml，流动相定容至10ml棕色容量瓶中，摇匀，按上述色谱条件分别进样20μl测定。结果表明利血平进样量在0.016μg～3.2μg范围内与峰面积呈良好线性关系，纵轴截距和斜率之比为0.35％，标准曲线基本为通过原点的直线(表4)。表4利血平进样量和峰面积线性关系试验数据 精密称取同一份萝芙木药材粉末各2g，总共6份，按照实施例1项下的方法分别测定，利血平含量RSD＝2.47％(n＝6)，方法重现性良好。分别精确称取已测定利血平含量的萝芙木药材约2g，共三组，每组3份，再分别加入相当于样品含量约80％、100％、120％的利血平标样，按照实施例1项下的方法测定利血平含量，并计算回收率，利血平的回收率在97.7％～99.4％之间，平均值为98.7％，RSD＝2.83％(n＝9)，测定的准确性良好，符合含量测定要求。六、有益效果本专利技术的技术进步在于(1)经过系统的比较研究，首次建立了；(2)方法具有分离效果好，测定准确，灵敏高，专属性强、分析简便快速等技术特点；(3)分析快速，萝芙木各成分吸收峰可在40分钟内全部流出色谱柱；(4)该方法对准确掌握品种选育、栽培种植优化、提取加工等过程中有效成分利血平的变化，有直接的应用价值。七具体实施例方式下面的具体实施例可进一步说明本专利技术，但并不构成对本专利技术权利要求所保护的范围的限制。其工作原理和过程为萝芙木的提取液注入高效液相色谱仪，由乙腈-甲醇-0.01％三乙胺组成的流动相载着利血平等成分进入色谱柱，以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱将利血平和其它化学成分分离，使它们依次到达紫外检测器并被识别；检测器测定萝芙木样品中利血平峰的响应值，分别对应其进量的多少，通过其响应值的大小和利血平标样的比较来计算萝芙木样品中利血平的含量。实施例1取萝芙木药材干燥后粉为粗粉，精密称取约2g，置100ml圆底烧瓶中，准确加入甲醇50ml，称重，水浴回流提取1小时，放冷，以甲醇补足减失的重量，过滤，续滤液经0.45um膜过滤，即为供试品溶液。测定的条件选用Phenomenex公司Luna C-18柱；以乙腈-甲醇-0.01％三乙胺水溶液(45-10-45)为流动相，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长268nm；进样体积20ul。测定结果如表5。表5不同产地的萝芙木类研究样品及测定结果 实施例2取样品Y-3和Y-4按照实施例1制备供试品溶液。测定的条件改变流动相比例为乙腈-甲醇-0.01％三乙胶水溶液(35-25-40)，其余条件同实施例1。测定结果如表6。表6不同产地的萝芙木类研究样品及测定结果 实施例3取样品C-3和C-4按照实施例1制备供试品溶液。测定的条件改变流动相为乙腈-甲醇-0.01％三乙胺水溶液(40-20-40)，其余条件同实施例1。测定结果如表7。表7不同产地的萝芙木类研究样品及测定结果 权利要求1.一种，其特征在于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定萝芙木属植物中利血平含量的高效液相色谱方法，其特征在于：（１）色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂；（２）流动相为乙腈、甲醇、０．０１％三乙胺水溶液组成的混合溶剂，其组成的体积比例为乙腈４５％～３５％、甲醇１０％～２５ ％、三乙胺水溶液４５％～４０％；（３）检测波长２６８ｎｍ，柱温４０℃，流速１ｍｌ／ｍｉｎ，进样体积２０ｕｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龚云麒，张慧颖，饶高雄，蔡传涛，
申请(专利权)人：饶高雄，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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