冷冻干燥生物样品的装置和方法制造方法及图纸

公开了用于冷冻干燥哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法和装置。方法可包括将生物样品放置在结构例如预冷却的金属表面上或其中以降低生物样品的温度，并随着生物样品置于密闭腔室中，施加真空至该腔室以降低腔室内的压力，冷却腔室以降低腔室内的温度和施加热至腔室内的生物样品。生物样品可以包括干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导的多功能干细胞、精子、卵母细胞、胚胎、卵巢组织、子宫组织或睾丸组织中的一种或多种。也公开了再水化样品的方法。

Apparatus and method of freeze drying biological samples

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】冷冻干燥生物样品的装置和方法专利技术背景本申请要求2018年1月22日提交临时申请序列号62/619,934和2018年2月25日提交的临时申请序列号62/634,868的优选权。将这些申请中的每个的全部内容通过引入并入本文。
本申请涉及冷冻干燥比如精子、卵母细胞、胚胎、生殖组织和干细胞等生物样品的方法以及进行这种冷冻干燥的装置。
技术介绍
冷冻保存对于两性配子以及许多家养和野生物种的胚胎都非常有效。各种物种都有其独特的方面、敏感性和限制性，但种质可以冷冻保存、存储并最终用于辅助生殖程序。然而，这种有效的冷冻保存方法价格昂贵。将冷冻保存的样品存储在液氮(LN)下具有很高的维护成本并且需要专门的专用设施和训练有素的工作人员。另外，运输麻烦且非常昂贵，并且需要有保证的且连续的LN供应。另一个缺点是，由于“脏的”LN或由于被污染的样品在样品之间存在病原体传播的风险。在液氮中存储生物样品的另一个缺点是储罐故障和样品的不可逆损失的风险。除了这些内在问题之外，LN的工业生产和分销以及专门的存储设施的能源需求具有严重的环境影响，留下大量的碳足迹。提供液氮冷冻保存的替代方案将是有利的。这种替代方案通过降低成本、简化工艺、降低污染的风险并且使对环境的影响最小化而克服上述限制性和缺点。
技术实现思路
本专利技术通过提供冷冻干燥精子细胞、卵母细胞、胚胎以及比如卵巢、子宫和睾丸等的生殖组织的干燥过程克服了对于包括精子细胞、卵母细胞、胚胎和生殖组织的生物样品的液氮冷冻保存的缺点和不足。使用本文公开的设备，将生物样品浸入在特殊的冷冻干燥溶液/多种该溶液中，并且然后冷冻并干燥。通过随后再水化的结果使得可以用于辅助生殖技术，比如体外受精(IVF)、卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)、包括植入前基因筛查(PGS)的基因筛查、包括植入前基因诊断(PGD)的基因诊断测试等。本专利技术的液氮冷冻保存替代方案也可以用于干细胞保存。本专利技术既提供了冷冻干燥保存的工艺，又提供了进行这种工艺的装置，以下将对其二者进行详细描述。该工艺涉及低温脱水工艺，其涉及快速冷冻生物样品，降低压力并通过升华去除冰。这以小体积进行，其有利地加快了该工艺。根据本专利技术的一个方面，提供了用于冷冻干燥比如哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法，该方法包括将生物样品的液滴、小体积或切片中的一种或多种放置在具有腔室的装置中，并且随着生物样品在密闭腔室中，施加真空至腔室以降低腔室内的压力，冷却腔室以降低腔室的温度并且施加热至腔室内的生物样品。在一些实施方式中，为了增加样品的温度，当预冷却的表面在腔室内时，将生物样品放置在该预冷却的金属表面；在其他实施方式中，将生物样品放置在腔室外部的所述预冷却的金属表面上或小瓶中，并且随后将所述预冷却的表面放置在腔室内。在本文方法的一些实施方式中，生物样品包括来自人源或动物源的精子、卵母细胞、胚胎、卵巢组织、子宫组织或睾丸组织干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞或诱导的多功能干细胞的一种或多种。在一些实施方式中，将生物样品在LYO溶液中稀释。在一些实施方式中，LYO溶液由a)DMSO和碳水化合物或b)DMSO和蛋白质组成。在一些实施方式中，LYO溶液是蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖葡聚糖和海藻糖中的一种或多种与比如DMSO、EG、PG、甘油等的冷冻保护剂和比如HAS、FCS等的大分子以及比如虾青素、EGCG、抗坏血酸等的抗氧化剂的组合。在一些实施方式中，LYO溶液可以与缓冲液或培养基溶液一起，后者包括TCM-199、Tris、PBS或HepesTalp、RPMI-1640、达尔伯克氏改良伊格尔培养基中的一种或多种。在一些实施方式中，LYO溶液由Tris培养基、蛋黄、海藻糖和山梨糖醇组成。在一些实施方式中，LYO溶液含有10％的DMSO和10％的HSA。在一些实施方式中，方法包括将样品暴露在逐渐降低浓度的LYO溶液中知道达到最终浓度。在一些实施方式中，冷却腔室的步骤包括将腔室的至少一部分插入在液氮或其他低温流体的容器中的步骤。在一些实施方式中，当腔室被放置在液氮的容器中时，腔室中的冷凝器和/或生物样品可以保持在液氮的液位以上。在一些实施方式中，腔室中的温度通过腔室/冷凝器相对于液氮液位的高度(level)来调节。在一些实施方式中，将生物样品以缓慢的速率冷却至-3℃和-10℃之间的接种温度，并且进一步冷却至-7℃和-50℃之间的零下温度。在一些实施方式中，腔室由聚碳酸酯、聚丙烯或特氟龙的塑料材料组成。在一些实施方式中，Lyo溶液是冻干保护的添加剂的百分比和细胞浓度之间的比率。在一些实施方式中，冻干保护性添加剂是DMSO或海藻糖。根据本专利技术的另一个方面，提供了冷冻干燥和再水化生物样品的方法，其包括a)将含有至少一种生物样品的载体插入到第一LYO溶液中；b)将载体从第一LYO溶液去除并将载体放置在第二LYO溶液中，第二LYO溶液不同于第一LYO溶液；c)将载体放置在装置的腔室中，该腔室具有用于存放所述至少一种生物样品的容器和用于降低腔室内温度的冷凝器；d)通过施加真空至腔室以降低腔室内的压力、降低腔室内的温度并加热至少一种生物样品来冷冻干燥至少一种生物样品；和e)在步骤(c)之后，将载体从装置去除并将载体插入到第三溶液，并且随后将载体从第三溶液去除并将载体插入到第四溶液以将至少一种生物样品再水化。在一些实施方式中，将样品在22℃、30℃或37℃的温度下在再水化溶液中进行再水化，该再水化溶液在培养基中含有包括用于再水化干细胞的山梨糖醇、蔗糖和/或海藻糖中的一种或多种的糖。在一些实施方式中，将干燥的细胞暴露于比如UV等的辐射。在优选的实施方式中，腔室具有小于或等于两升的容积，并且在更优选的实施方式中，具有小于或等于1.5升的容积，并且在更优选的实施方式中，具有小于或等于1升的容积。在优选的实施方式中，从生物样品至冷凝器的距离等于或小于10cm，并且在更优选的实施方式中，从生物样品至冷凝器的距离等于或小于2cm。根据另一个方面，提供了用于在37℃的温度下在再水化溶液中再水化样品的方法，该再水化溶液含有糖，比如用于再水化精子的在蛋黄溶液和TRIS培养基中的山梨糖醇、蔗糖和海藻糖和用于再水化卵母细胞、胚胎或卵巢组织的1M海藻糖或蔗糖。根据另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的方法，其包括将生物样品放置在具有密闭腔室的装置中，该密闭腔室被限定为其中压力将被降低的装置内的区域并且腔室具有小于或等于1.5升的容积。方法进一步包括施加真空至腔室以降低腔室内的压力，冷却腔室以降低腔室内的温度，以及施加热至腔室中的生物样品。在一些实施方式中，该容积小于或等于1升。根据本专利技术的另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的方法，该方法包括将生物样品放置在具有密闭腔室的装置中，该密闭腔室被限定为其中压力将被降低的装置内的区域，并且腔室具有在其中限定的容积。装置具有在腔室内的冷凝器，其中生物样品被放置在腔室内使得冷凝器与样品之间的距本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于冷冻干燥哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法，所述方法包括将所述生物样品的液滴或小体积或切片的一种或多种放置在结构上或内以降低所述生物样品的温度，并且随着所述生物样品处于密闭腔室中施加真空至所述腔室以降低所述腔室内压力，冷却以降低所述腔室内的温度和施加热至所述腔室内的所述生物样品。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180122 US 62/619,934;20180225 US 62/634,8681.一种用于冷冻干燥哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法，所述方法包括将所述生物样品的液滴或小体积或切片的一种或多种放置在结构上或内以降低所述生物样品的温度，并且随着所述生物样品处于密闭腔室中施加真空至所述腔室以降低所述腔室内压力，冷却以降低所述腔室内的温度和施加热至所述腔室内的所述生物样品。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结构是预冷却的金属表面，并且当所述预冷却的表面在所述腔室内时，将所述生物样品放置在所述预冷却的金属表面上。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述结构是预冷却的金属表面或小瓶，并且将所述生物样品放置在所述腔室外的所述预冷却的金属表面上或所述小瓶内，并且随后将所述预冷却的表面或小瓶放置在所述腔室内。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述生物样品包括来自人源或动物源的干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导的多功能干细胞中的一种或多种。


5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述生物样品包括精子、卵母细胞、胚胎、卵巢组织、子宫组织或睾丸组织中的一种或多种。


6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中将所述生物样品稀释在冻干溶液中。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述LYO溶液由a)DMSO和碳水化合物或b)DMSO和蛋白质组成。


8.根据权利要求6所述的方法，其中所述LYO溶液是蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖葡聚糖和海藻糖中的一种或多种与DMSO、EG、PG、甘油中的一种或多种的冷冻保护剂和HAS、FCS中的一种或多种的大分子及虾青素、EGCG、抗坏血酸中的一种或多种的抗氧化剂的组合。


9.根据权利要求6所述的方法，其中所述LYO溶液与包括TCM-199、Tris、PBS或HepesTalp、RPMI-1640、达尔伯克氏改良伊格尔培养基中的一种或多种的缓冲液或培养基溶液一起。


10.根据权利要求6所述的方法，其中所述LYO溶液包括Tris培养基、蛋黄、海藻糖和山梨糖醇。


11.根据权利要求6所述的方法，其中所述LYO溶液含有10％的DMSO和10％的HSA。


12.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，进一步包括将所述生物样品暴露于所述LYO溶液的逐渐降低的浓度直到达到最终浓度。


13.根据任一前述权利要求所述的方法，进一步包括控制所述腔室内的温度的步骤。


14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中冷却所述腔室的步骤包括将所述腔室的至少一部分插入低温流体的容器中的步骤。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述低温流体是液氮，并且当将所述腔室放置在所述液氮的容器中时，所述腔室中的冷凝器保持在所述液氮的液位上方。


16.根据权利要求14所述的方法，其中所述低温流体是液氮，并且当将所述腔室放置在所述液氮的容器中时，所述生物样品保持在所述液氮的液位上方。


17.根据权利要求14所述的方法，其中所述低温流体是液氮，并且所述腔室内的温度通过所述腔室内的冷凝器相对于所述液氮的液位的高度来调节。


18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述生物样品以缓慢的速率冷却至在-3℃和-10℃之间的接种温度，并进一步至-7℃和-50℃之间的零下温度。


19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述腔室由聚碳酸酯、聚丙烯或特氟龙的塑料材料组成。


20.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述Lyo溶液是冻干保护的添加剂的百分比与细胞浓度之间的比率。


21.根据权利要求20所述的方法，其中所述冻干保护性添加剂是DMSO或海藻糖。


22.一种用于冷冻干燥和再水化哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法，其包括：
a)将含有至少一种生物样品的载体插入到第一LYO溶液；
b)从所述第一LYO溶液去除所述载体并将所述载体放置在第二LYO溶液中，所述第二LYO溶液不同于所述第一LYO溶液；
c)将所述载体放置在装置的腔室中，所述腔室具有用于存放所述至少一种生物样品的容器和用于降低所述腔室的温度的冷凝器；
d)通过施加真空至所述腔室以降低所述腔室内的压力，降低所述腔室内的温度，并且加热所述至少一种生物样品，冷冻干燥所述至少一种生物样品；和
e)在步骤(c)之后从所述装置去除所述载体并将所述载体插入到第三溶液并随后从所述第三溶液去除所述载体并将所述载体插入到第四溶液以再水化所述至少一种生物样品。


23.根据权利要求22所述的方法，其中将所述生物样品在22℃、30℃或37℃的温度下在再水化溶液中进行再水化，所述再水化溶液在培养基中含有用于再水化干细胞的包括山梨糖醇、蔗糖和/或海藻糖中的一种或多种的糖。


24.根据权利要求23所述的方法，其中将干燥的细胞暴露于辐射比如UV。


25.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述腔室具有小于或等于2升的容积。


26.根据权利要求25所述的方法，其中所述腔室具有小于或等于1升的容积。


27.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在所述腔室内所述生物样品至所述冷凝器的距离等于或小于10cm。


28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物样品至所述冷凝器的距离等于或小于2cm。


29.一种用于在37℃的温度下在再水化溶液中再水化样品的方法，所述再水化溶液含有用于再水化精子的在蛋黄溶液和TRIS培养基中的包括山梨糖醇、蔗糖和海藻糖的一种或多种的糖类和用于再水化卵母细胞、胚胎或卵巢组织的1M海藻糖或蔗糖。


30.一种用于冷冻干燥哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法，所述方法包括将生物样品放置在具有密闭腔室的装置中，所述密闭腔室限定为其中压力将降低的所述装置内的区域，所述腔室具有小于或等于1.5升的容积，施加真空至所述腔室以降低所述腔室内的压力，冷却所述腔室以降低所述腔...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·阿拉夫，
申请(专利权)人：安全生殖公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL