一种干细胞冻存液及其制备和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种干细胞冻存液及其制备和使用方法，该冻存液包括DMSO 0‑20％、甘油1‑2％、海藻糖1‑2％、乙醇2‑5％、N‑十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8‑桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。使用本发明专利技术冻存液冻存后干细胞复苏率达到90％以上，增殖速度与未冻存细胞相比不仅无明显降低，甚至增殖速度加快。

A cryopreservation solution for stem cells and its preparation and application method

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞冻存液及其制备和使用方法
本专利技术涉及细胞生物学
，具体涉及一种干细胞冻存液及其制备和使用方法。
技术介绍
干细胞是一类具有高度自我更新增殖和多向分化潜能的细胞，包括神经干细胞、间充质干细胞等，其在一定的条件下可分化成多种类型的细胞。干细胞具有多种用途和功能，可用于体外研究组织器官的生长发育、建立疾病模型、药物筛选，也可用于疾病治疗。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。干细胞具有良好的临床应用前景，其长期安全稳定保存是一重要问题。低温冻存是实现干细胞长期保存的常用方法，但冷冻保存的过程的冰晶以及溶液效应等均对细胞产生一定的损伤。干细胞冻存液可保护细胞免受低温冻存中的冷冻损伤，能更好地保存细胞的生物性能。经典干细胞冻存液含有DMSO和胎牛血清，然而，DMSO虽可降低保存液的冰点并减少胞内冰的形成，但DMSO自身也具有一定的毒性，有研究也表明，高含量DMSO可能会改变染色体的稳定性，并导致细胞端粒长度的变化，反过来导致肿瘤的形成。胎牛血清可能含有动物源性病原体，也存在一定的安全问题。目前的干细胞冻存液的使用效果不甚理想，因此，研发一种有效防止细胞低温损伤和保持细胞活力的干细胞冻存液至关重要。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供一种干细胞冻存液及其制备和使用方法。本专利技术方案包括以下方面：一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，DMSO0～20％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8-桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。优选的，所述干细胞冻存液包括以下组份：按质量百分比，DMSO0～5％、甘油1～2％、海藻糖1-2％、乙醇2～3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C0.03～0.04％、葫芦巴碱0.03～0.05％、1,8-桉叶素0.02～0.03％、余量是DMEM培养基。更优选的，所述的干细胞冻存液包括以下组份：按质量百分比，DMSO0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。本专利技术所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞。所述成体干细胞优选为脂肪间充质干细胞。本专利技术还提供了所述的干细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：将猪苓酸C与磷酸钙混合均匀，得混合物A；将N-十二烷酰基肌氨酸、葫芦巴碱、1,8-桉叶素与乙醇混合，20～25℃且100～150rpm搅拌条件下加入混合物A和/或DMSO，混合5～10min；依次加入甘油、海藻糖和DMEM培养基，混匀即得干细胞冻存液。优选的，制备方法中，将猪苓酸C与磷酸钙混合，在30～35℃条件下均匀，保温备用。本专利技术还提供所述的干细胞冻存液的使用方法：将细胞悬液与干细胞冻存液混匀，装入冻存管中，冻存管先在0～2℃放置30～35min，然后-30～-35℃放置60～70min，-60～-65℃放置9～10h，之后采用-196℃液氮进行冻存。优选的，细胞悬液与干细胞冻存液混匀后，细胞密度为4×106个/ml。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种干细胞冻存液，包括DMSO、甘油、海藻糖、乙醇、N-十二烷酰基肌氨酸、磷酸钙、猪苓酸C、葫芦巴碱、1,8-桉叶素、DMEM培养基等组份。本专利技术冻存液能够有效抑制细胞内冰晶的产生，在冻存和复苏过程中维持蛋白质的稳定性，保持甚至促进冻存后细胞活性。使用本专利技术冻存液冻存后干细胞复苏率达到90％以上，增殖速度与未冻存细胞相比不仅无明显降低，甚至增殖速度加快。通过组份配比的优化，不仅能够维持95.9％的复苏率，且可无需使用DMSO，避免了DMSO可能带来的安全问题，降低成本。本专利技术还发现冻存方法也会对复苏率产生影响，采用本专利技术冻存方法，先在0～2℃放置30～35min，然后-30～-35℃放置60～70min，-60～-65℃放置9～10h，之后采用-196℃液氮进行冻存，复苏率最好。制备方法的优化，不仅使得复苏率达到98.7％，且能有效提高增殖速度。附图说明图1：实验例生长曲线测定结果统计图具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。本专利技术所述1,8-桉叶素，CAS号：470-82-6，分子式C10H18O所述N-十二烷酰基肌氨酸，CAS号：97-78-9，分子式:C15H29NO3所述猪苓酸C，CAS号：465-18-9，分子式：C31H46O4所述葫芦巴碱，CAS号：535-83-1，分子式:C7H7NO2所述1,8-桉叶素，CAS号：470-82-6，分子式:C10H18O所述DMSO为二甲基亚砜。DMEM培养基(Hyclone公司，SH30021.02)实施例1一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，DMSO5％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇2％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05％、磷酸钙1.0％、猪苓酸C0.03％、葫芦巴碱0.03％、1,8-桉叶素0.04％、余量是DMEM培养基。实施例2一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，DMSO5％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇2％、N-十二烷酰基肌氨酸0.07％、磷酸钙0.7％、猪苓酸C0.03％、葫芦巴碱0.03％、1,8-桉叶素0.03％、余量是DMEM培养基。实施例3一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，DMSO0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。实施例4一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，DMSO20％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05％、磷酸钙1.0％、猪苓酸C0.06％、葫芦巴碱0.02％、1,8-桉叶素0.01％、余量是DMEM培养基。实施例1-4所述的干细胞冻存液的制备方法为：将各成分于20～25℃且100～150rpm搅拌条件下混合均匀，得干细胞冻存液，保温备用。实施例5本例与实施例1的主要区别是：干细胞冻存液的制备方法为：将猪苓酸C与磷酸钙混合均匀，在30～35℃条件下均匀，得混合物A，保温备用；将N-十二烷酰基肌氨酸、1,8-桉叶素与乙醇混合，20～25℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，/nDMSO 0～20％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8-桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO0～20％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8-桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。


2.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，DMSO0～5％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C0.03～0.04％、葫芦巴碱0.03～0.05％、1,8-桉叶素0.02～0.03％、余量是DMEM培养基。


3.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，DMSO0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。


4.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王忠伟，李巍，陈爱花，符春娱，
申请(专利权)人：海南济民博鳌国际医院有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46