卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置及其应用方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种微流体细胞处理模块，及包含该模块的卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置。该装置可实现对卵母细胞及胚胎进行低温保护剂加载、冷冻、复温和低温保护剂去除的操作。

Integrated device for automatic vitrification of oocytes and embryos and its application

【技术实现步骤摘要】
卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置及其应用方法
本专利技术涉及一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，该装置采用微流控技术对卵母细胞及胚胎直接在石英毛细管中进行低温保护剂加载和自动玻璃化保存，并在复温后进行低温保护剂去除。
技术介绍
世界范围内不孕率逐年升高，发达国家不孕症患病率达5％～8％，而发展中国家可高达30％。卵母细胞及胚胎的冷冻保存可为由于年龄及医疗因素引起的卵巢功能衰退的女性保存生育能力。通过胚胎冷冻保存，可以增加进行体外受精-胚胎移植患者的妊娠机会，根据患者具体情况选择移植时间，减少严重卵巢过度刺激综合征，还能避免多余胚胎的浪费，减少治疗费用，但该方法主要适用于已有配偶或有供精的育龄期女性。若患者没有性伴侣或在取卵手术当日取精失败时为了不放弃治疗周期，可选择卵母细胞低温保存技术。哺乳动物的卵母细胞和胚胎在冷冻保存过程中很容易受到不同类型的冷冻损伤，这些损伤的发生是与卵母细胞或者胚胎的低温生物学特性密切相关的，如对低温的敏感性、质膜对水和冷冻保护剂的渗透性、对冷冻保护剂化学毒性的灵敏度以及对渗透性膨胀和收缩的耐受性等。为此，要达到成功冷冻保存的效果,就要建立一种损伤最小化同时能保持高存活率的方法。目前的研究表明，慢速冷冻法由于形成了细胞内外的冰晶，对细胞内部骨架结构和亚细胞器膜产生尖锐刺伤和牵拉断裂，冻存后卵母细胞和胚胎的成活率和移植率低。玻璃化冷冻是以极快的降温速率将高浓度低温保护剂在短时间内直接转化为非晶态固体的过程，由于有效避免了冰晶的产生，是一种高效的冷冻保存方法。实现玻璃化冷冻需要在细胞内外加载高浓度的低温保护剂，为了减少高浓度的低温保护剂对细胞造成的渗透损伤，需要采用分步法加载和去除保护剂。目前，临床上多采用crytop法进行卵母细胞和胚胎的玻璃化保存，其步骤如下：低温保护剂加载和玻璃化步骤中，首先需要将细胞移入20uL基础溶液(BasicSolution，BS)[组织培养液(TCM)199]中，然后分三次加入平衡溶液(EquilibrationSolution，ES)[组织培养液(TCM)199+7.5％EG+7.5％DMSO]20uL、20uL、240uL，分别处理3min、3min、9min，之后再利用巴斯德管分两次把细胞移入各300uL玻璃化溶液(VitrificationSolution，VS)[组织培养液(TCM)199+15％EG+15％DMSO+0.5mol/L蔗糖]中分别处理0.5min、0.5min，最后将细胞在显微镜下转移到cryotop载体上，快速浸入液氮中玻璃化；复温和低温保护剂去除步骤中，首先需要将加载有细胞的Cryotop快速移入已预热好的4mL复温溶液(ThawingSolution，TS)[组织培养液(TCM)199+1mol/L蔗糖]中将细胞从Cryotop载体上脱离并快速复温1min，然后用巴斯德管将细胞转移入300uL稀释溶液(DiluentSolution，DS)[组织培养液(TCM)199+0.5mol/L蔗糖]中处理3min，最后分两次将细胞移入各300uL洗涤溶液(WashingSolution，WS)[组织培养液(TCM)199]中分别处理5min、1min，处理完毕后将细胞转移到培养油中放入培养箱恢复。分步加载-去除保护剂的方法使细胞在不同浓度的溶液间转移，虽在一定程度上减少了渗透损伤，但细胞外溶液渗透压在转移过程中仍会发生阶梯状突变，此时卵母细胞还是会受到较大的渗透损伤。另一方面，保护剂加载和去除过程需要操作人员精确控制细胞在保护剂中的渗透时间，在短时间内完成细胞的多次转移，在转移过程中极易造成细胞丢失，对操作人员的技术要求高。目前卵母细胞和胚胎的玻璃化保存全部由人工操作，完成效率低，一个熟练的操作员一天也只能处理3～5个患者的细胞，随着逐年保存需求的增大，人工操作将逐渐难以满足保存需求，且人为因素存在着一定的不确定性，开发卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置十分有必要。针对现有技术存在的上述问题，中国专利公开号CN105831105A公开了一种微流体细胞处理芯片及其应用方法，提供一种在保护剂加载/去除过程中能使低温保护剂浓度连续变化的微流体细胞处理芯片，操作时低温保护剂经蛇形通道混合流入细胞操作腔，通过使用细胞口吸器人工控制细胞进出细胞操作腔，并依靠操作腔中的圆柱形障碍物将细胞限制于细胞腔中，该种芯片及细胞处理方法虽然可以完成卵母细胞及胚胎冷冻保护剂的连续性加载与去除，但在制作与应用方面仍然存在诸多问题：(1)芯片采用软光刻法制作，需要经过光刻开模，倒胶成型、分层键合等步骤，工艺较为复杂，制作成本较高；(2)细胞通过细胞口吸器人工控制进出细胞操作腔，完成保护剂加载后需要将细胞从芯片中取出，再加载至载体，增加了操作难度且后期较难实现自动化。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对上述缺陷，提供一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置及其应用方法。采用微流控技术实现保护剂溶液浓度的连续变化，取代了细胞在不同浓度的溶液间的人工转移；采用石英毛细管作为保护剂加载和去除以及细胞冷冻载体，简化了原有的细胞进入及取出芯片方式；设计了可旋转细胞冷冻台，将冷冻载体与液氮容器进行整合实现了低温保护剂加载/细胞冷冻/保护剂去除一体化，实现了装置的自动化。另外在加工工艺方面用PMMA材料替代原有的PDMS材料采用激光切割技术批量制作芯片，与PDMS材料制作方法相比大大简化了芯片的加工工艺，节省减小了加工成本。本专利技术的目的之一是提供一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，该装置包括微流体细胞处理芯片系统、石英毛细管、旋转细胞冷冻台。本专利技术的目的之二是提供一卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置的应用方法，将保护剂加载/玻璃化冷冻/保护剂去除过程整合起来，实现卵母细胞及胚胎的自动玻璃化保存。具体地：本专利技术提供了一种微流体细胞处理模块，其特征在于：包括微流体芯片本体；所述微流控芯片本体包括顶层、通道层、底层；所述通道层设置于顶层和底层之间；所述通道层上设有的至少两个试剂流入通道、蛇形试剂混合管道和混合试剂流出通道；所述各试剂流入通道互呈一定角度的设置于蛇形试剂混合管道的头端；所述混合试剂流出通道设置于蛇形试剂混合管道的末端。进一步地，本专利技术提供的一种微流体细胞处理模块，其特征还在于：所述试剂流入通道，包括第一试剂流入通道和第二试剂流入通道；所述第一试剂流入通道和第二试剂流入通道互呈锐角的夹角。进一步地，本专利技术提供的一种微流体细胞处理模块，其特征还在于：所述蛇形试剂混合管道的深度与宽度比为1-2：1。另外，本专利技术还提供了一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：包括上述的微流体细胞处理模块、进样模块、毛细管模块；其中，所述进样模块，包括可与试剂流入通道连通的进样设备；所述进样设备与试剂流入通道一一对应；所述毛细管模块，包括毛细管载体单元和细胞冷冻平台；所述毛细管载体单元，包括毛细管载体和升降机构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微流体细胞处理模块，其特征在于：包括微流体芯片本体；/n所述微流控芯片本体包括顶层、通道层、底层；/n所述通道层设置于顶层和底层之间；/n所述通道层上设有的至少两个试剂流入通道、蛇形试剂混合管道和混合试剂流出通道；/n所述各试剂流入通道互呈一定角度的设置于蛇形试剂混合管道的头端；/n所述混合试剂流出通道设置于蛇形试剂混合管道的末端。/n

【技术特征摘要】
1.一种微流体细胞处理模块，其特征在于：包括微流体芯片本体；
所述微流控芯片本体包括顶层、通道层、底层；
所述通道层设置于顶层和底层之间；
所述通道层上设有的至少两个试剂流入通道、蛇形试剂混合管道和混合试剂流出通道；
所述各试剂流入通道互呈一定角度的设置于蛇形试剂混合管道的头端；
所述混合试剂流出通道设置于蛇形试剂混合管道的末端。


2.如权利要求1所述的一种微流体细胞处理模块，其特征在于：
所述试剂流入通道，包括第一试剂流入通道和第二试剂流入通道；
所述第一试剂流入通道和第二试剂流入通道互呈锐角的夹角。


3.如权利要求1所述的一种微流体细胞处理模块，其特征在于：
所述蛇形试剂混合管道的深度与宽度比为1-2：1。


4.一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：包括如权利要求1-3任一所述的微流体细胞处理模块、进样模块、毛细管模块；
其中，所述进样模块，包括可与试剂流入通道连通的进样设备；
所述进样设备与试剂流入通道一一对应；
所述毛细管模块，包括毛细管载体单元和细胞冷冻平台；
所述毛细管载体单元，包括毛细管载体和升降机构；
所述毛细管载体呈漏斗状的第一端部与混合试剂流出通道连通，在升降机构的作用下进行垂直方向的往复运动；
所述细胞冷冻平台，包括至少两个安装于细胞冷冻平台外视面上的容器和控制细胞冷冻平台转动的转动机构；
所述容器，在转动机构的作用下，于毛细管载体的下方进行切换。


5.如权利要求4所述的一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：
所述容器中的至少一个，具有滤片；
所述毛细管载体在向下运动的过程中，其第二端部正好贴合在滤片表面；
所述容器中的至少一个，内置有冷却介质。


6.如权利要求5所述的一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：
所述滤片的孔径小于目标卵母细胞及胚胎的直径。


7.如权利要求4所述的一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：
所述毛细管载体单元还包括转接机构；
所述转接机构安装于毛细管载体的第一端部和混合试剂流出通道之间；
所述升降机构控制转接机构的升降行为。


8.如权利要求4所述的一种卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：
所述毛细管载体的管体部分外径为0.2-0.4mm，壁厚0.01-0.05mm，长为8-12cm；
所述漏斗状的第一端部，其开口直径为5-10mm，长为1-2cm。


9.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：周新丽，喻梓瑄，曹宁，彭湉，杜羽琨，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31