一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液技术

本发明专利技术公开了一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液，属于干细胞保存和培育技术领域，干细胞冻存方法包括以下步骤：S1、配制Ⅰ液；S2、配制Ⅱ液；S3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，得到细胞悬液，然后进行离心；S4、取用Ⅰ液重悬细胞；S5、取用Ⅱ液重悬细胞；S6、将冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存，干细胞冻存液包括Ⅰ液和Ⅱ液，Ⅰ液包括人血白蛋白、bFGF和EGF，Ⅱ液包括血清替代物细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜，本发明专利技术的优点在于提高细胞冻存品质和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液
本专利技术涉及干细胞保存和培育
，特别涉及一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下了分化为多种功能细胞，根据干细胞所处的发育阶段，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。脂肪间充质干细胞是存在于脂肪组织的成体多能干细胞，在一定条件下课分化为骨、软骨、心肌、神经、脂肪等多种组织细胞。目前脂肪间充质干细胞在人体抗衰老方面的研究已取得很多进展，在神经系统、免疫系统、运动系统等系统的疾病治疗方面也在不断突破。它作为再生医学资源，在人体抗衰老和疾病治疗都有非常重要的价值。干细胞的保存对于干细胞的应用起着基础性的作用。将干细胞从人体组织中分离培养后，经过鉴定检测合格后，将其保存，以便于临床的使用。细胞冻存是指将细胞置于低温环境中，是细胞暂时处于停止生长的状态，以保持其细胞生物学特性。在冻存中会使用细胞保存液(也称为细胞冻存液)作为供给细胞生命代谢所需营养物质，同时也要防止在冷冻中所产生的冰晶对细胞的损伤。目前常规的细胞冻存液，主要是由胎牛血清、细胞培养液、二甲基亚砜(DMSO)等物质组成。但胎牛血清属于异源性物质，存在引入污染和过敏源的风险，可能会引起未知的不良反应，以及会影响临床治疗的效果，因此不适于临床的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液，其优点在于选用人血白蛋白作为主料降低冰晶形成数量，降低细胞在冻存时结冰晶而造成的机械损伤，人血白蛋白配合、bFGF和EFG的混合液、甜菜碱等辅料使细胞建立一层保护机制，提高细胞冻存品质和稳定性，延长保质期，有利于大批量干细胞生产平台批量使用，降低综合成本。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：S1、配制Ⅰ液：将1％bFGFw/v与1％EGFw/v混合与人血白蛋白中，取混合液定容至100ml，将混合液保存备用；S2、配制Ⅱ液：将血清替代物KnockoutSerumreplacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜依次加入并混合，之后取混合液保存备用；S3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，立即用培养基终止消化，得到细胞悬液，之后用移液管将细胞悬液转移至离心管中，进行离心，舍弃上层清液；S4、取用Ⅰ液重悬细胞，并且在4℃的温度条件下孵育10min；S5、取用Ⅱ液重悬细胞，之后将细胞悬液分装至2ml冻存管中；S6、将分装完成的冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存。进一步的，在步骤S1中，混合液置于4℃环境保存。进一步的，在步骤2中，取混合液之后，将混合液于4℃环境预冷备用；或者将混合液分装，然后置于-20℃冰箱中长期保存，使用前4℃融化后使用。进一步的，在步骤S3中，离心处理中，离心机的转速为1100rpm，离心时间为5min。进一步的，在步骤S5中，Ⅱ液的干细胞冻存密度为1×106cell/ml，每个试管中Ⅰ液和Ⅱ液混合后冻存液的含量为1ml。进一步的，在步骤S6中，在冻存管置于液氮中长期保存之前，放入-80℃冰箱保存1-2天。一种细胞冻存液，包括Ⅰ液和Ⅱ液，其中Ⅰ液包括人血白蛋白、bFGF和EGF，其中bFGF的浓度为：1％w/v，EGF的浓度为：1％w/v，使用人血白蛋白定容至100ml；Ⅱ液包括组分：血清替代物KnockoutSerumreplacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜，其中：细胞色素C的浓度为：1.2％w/v、甜菜碱的浓度为：0.3％w/v、抗冻蛋白的浓度为：0.3％w/v、葡萄糖的浓度为：3.5％w/v、低分子葡聚糖的浓度为：1.5％w/v、甘露聚糖的浓度为：：1％w/v、氯化钠的浓度为：0.1％w/v、乳酸钠的浓度为：0.1％w/v、乳酸钠的浓度为：0.1％w/v、氯化钾的浓度为：0.1％w/v、氯化钙的浓度为：0.2％w/v、二甲基亚砜的浓度为：3％w/v。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：1.使用人血白蛋白可形成水化膜，降低冰晶形成数量，降低细胞在冻存时结冰晶而造成的机械损伤，并且人血白蛋白能有效模拟人体内环境，能有效提高干细胞的保存时间，血清替代物包含细胞生长所必须的物质，包括生长因子，粘附因子，荷尔蒙，结合蛋白，维生素，微量矿物元素等，与传统的胎牛血清相比受污染的风险较小，保质时间长，适合大批量干细胞生产平台使用，降低成本；2.使用抗冻蛋白可以抑制冰晶生长，进一步防止冰晶而造成的机械损伤，提高细胞冻存液的保存效果；3.加入甜菜碱可以维持细胞渗透压、对酶的保护作用、抗盐的持久性和影响无机离子的分布，避免了细胞质高浓度无机离子对酶和代谢的毒害，甜菜碱的溶解度很高，不带静电荷，其高浓度对许多酶及其他生物大分子没有影响，还可以保护干细胞的细胞膜，甜菜碱本身良好的渗透调节剂，可以降低膜脂过氧化程度，可以促进细胞冻存液中钠离子和氯离子等进行运动，进一步模拟人体细胞存活环境，延长干细胞的冻存时间；4.使用氯化钠、乳酸钠、氯化钙和氯化钾等盐也是维持细胞外液的容量和渗透压起着非常重要的作用。5.细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用，提高干细胞存活率，同时由于二甲基亚砜本身具有一定的毒性，二甲基亚砜与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，导致干细胞中线粒体的生物酶失活，加入体外的细胞色素C，其与体外的二甲基亚砜发生作用，减小二甲基亚砜对干细胞内部的影响，从而减少二甲基亚砜的毒性，有利于干细胞进行更长时间的保存；6.使用葡萄糖、低分子葡聚糖和甘露聚糖，提供干细胞存活所需的能源。附图说明图1是干细胞冻存前的细胞状态示意图；图A-1是实验组干细胞复苏后24h的细胞状态示意图；图A-2是实验组干细胞复苏后48h的细胞状态示意图；图A-3是实验组干细胞复苏后72h的细胞状态示意图；图A-4是实验组干细胞复苏后96h的细胞状态示意图；图A-5是实验组干细胞复苏后120h的细胞状态示意图；图B-1是对照组干细胞复苏后24h的细胞状态示意图；图B-2是对照组干细胞复苏后48h的细胞状态示意图；图B-3是对照组干细胞复苏后72h的细胞状态示意图；图B-4是对照组干细胞复苏后96h的细胞状态示意图；图B-5是对照组干细胞复苏后120h的细胞状态示意图；图2是不同冻存液复苏后干细胞的生长曲线示意图。具体实施方式...

【技术保护点】
1.一种干细胞冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、配制Ⅰ液：将1％bFGF w/v与1％EGF w/v混合与人血白蛋白中，取混合液定容至100ml，将混合液保存备用；/nS2、配制Ⅱ液：将血清替代物Knockout Serum replacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜依次加入并混合，之后取混合液保存备用；/nS3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，立即用培养基终止消化，得到细胞悬液，之后用移液管将细胞悬液转移至离心管中，进行离心，舍弃上层清液；/nS4、取用Ⅰ液重悬细胞，并且在4℃的温度条件下孵育10min；/nS5、取用Ⅱ液重悬细胞，之后将细胞悬液分装至2ml冻存管中；/nS6、将分装完成的冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、配制Ⅰ液：将1％bFGFw/v与1％EGFw/v混合与人血白蛋白中，取混合液定容至100ml，将混合液保存备用；
S2、配制Ⅱ液：将血清替代物KnockoutSerumreplacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜依次加入并混合，之后取混合液保存备用；
S3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，立即用培养基终止消化，得到细胞悬液，之后用移液管将细胞悬液转移至离心管中，进行离心，舍弃上层清液；
S4、取用Ⅰ液重悬细胞，并且在4℃的温度条件下孵育10min；
S5、取用Ⅱ液重悬细胞，之后将细胞悬液分装至2ml冻存管中；
S6、将分装完成的冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存。


2.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤S1中，混合液置于4℃环境保存。


3.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤2中，取混合液之后，将混合液于4℃环境预冷备用；或者将混合液分装，然后置于-20℃冰箱中长期保存，使用前4℃融化后使用。


4.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦阳，王铁，朱迪·德瓦库玛，杨丽华，李靖，
申请(专利权)人：江苏瑞思坦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32