一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用。该试剂盒主要包括RNA提取体系、反转录体系和PCR反应体系。本发明专利技术试剂盒采用荧光定量PCR技术，对2个环状RNA，即hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284进行表达水平及表达差异情况的检测，为眼底血管性疾病提供了新的检测标记物和预后评估方法，本发明专利技术提供的试剂盒具有创伤性小和操作简单等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用
本专利技术属于生物医学检测
，尤其涉及一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用。
技术介绍
眼底血管性疾病是一类以眼底血管病变为特征的疾病，发病率逐年增高，已经成为全球公共卫生问题和社会经济负担。眼底血管性疾病包括增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)等。此类疾病已经成为从婴幼儿到老年人各个年龄阶段致盲和视力障碍的最主要原因，严重影响了患者的生活质量。该类疾病的重要病理特征为：视网膜无灌注、血管通透性增加和视网膜新生血管形成，其病程多累及黄斑、视盘，造成视力的严重损害甚至失明。目前，局部药物干预手段包括糖皮质激素治疗和玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子；手术治疗包括玻璃体切割、激光光凝和光动力学疗法。目前现有的治疗方法具有一定的局限性和较多的副作用。因此，寻找眼底血管性疾病的生物标志物，有助于探索底血管性疾病的发病机制、辅助诊断和判断疾病的进程，评估治疗效果。环状RNA(circRNA)在真核细胞质中大量存在，是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly尾巴以共价键形成环形结构的非编码RNA。与传统线性RNA相比，具有表达稳定性和序列高保守性等特征。circRNA参与生物体内多种生理过程的调控，包括细胞增殖、细胞分化、细胞周期和基因组印记等。circRNAs表达异常与许多疾病的发生发展(如肿瘤、心血管疾病和神经疾病等)密切相关。鉴于circRNA的特征及其疾病相关性，其有望成为诊断标志物和潜在药物靶点。房水属于眼内部物，由睫状体产生，经过瞳孔、小梁网等最终进入血液，且处于动态循环之中，其构成成分与眼部的局部生理及其病理环境密切相关。房水中含有大量的外泌体，外泌体作为机体内至关重要的细胞间相互交流的中介物质，包含circRNA、蛋白质、mRNA及其脂质等。房水中的circRNAs等分子可以通过外泌体形式进行细胞间的信息交流。针对房水中circRNA的表达检测，可以反映疾病的状态。迄今为止关于circRNA作为眼底血管性疾病诊断标志物的研究较少。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种眼底血管性疾病检测生物标记物，所述标记物为hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284，所述hsa_circ_0000615的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述标记物为房水中的circRNA。进一步地，所述hsa_circ_0000615的检测引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；所述hsa_circ_0000284的检测引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。一种眼底血管性疾病检测实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBRPremixExTaq2×(包括ExTaq酶，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，TBGreen)100μL，hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284特异性的qRT-PCR上游引物，hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284特异性的qRT-PCR下游引物，GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物；，引物各1管，10μM，100μL/管。进一步地，所述hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284的特异性qRT-PCR引物序列如权利要求2所示；所述GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQIDNO:3所示，下游引物序列如SEQIDNO:4所示。进一步地，所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括总RNA反转录引物(包括OligodT和Random6mers)，1管，浓度：50μM，50μL/管，反转录酶(200U/μL)50μL，dNTPMixture(10mMeach)50μL，反转录buffer50μL。进一步地，所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizolreagent，1管，2000μL/管；氯仿，1管，500μL/管；无水乙醇，1管，8000μL/管；DEPCddH2O，1管，1000μL/管；ddH2O，1管，2000μL/管；异丙醇，8000μL/管。如上述的生物标记物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测眼底血管性疾病诊断试剂中的应用。如上述的生物标记物在制备眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用。进一步地，所述眼底血管性疾病包括糖尿病视网膜病变、黄斑变性伴发脉络膜新生血中的至少一种。本专利技术中确定hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284作为眼底血管性疾病的诊断标记物包括如下步骤：第一步：样本准备：收集白内障病人的房水标本(对照组)、增殖性糖尿病视网膜病变(实验组)、湿性老年黄斑变性(实验组)，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。第二步：采用反转录试剂盒进行totalRNA的逆转录；第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在不同房水样本中的表达差异。本专利技术的另一目的在于分析hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284作为眼底血管性疾病的预后效果评估的可行性。实验步骤包括：第一步：样本准备：收集增殖性糖尿病视网膜病变(实验组)和湿性老年黄斑变性(实验组)病人治疗前后的房水标本，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。第二步：采用反转录试剂盒进行totalRNA的逆转录；第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在不同房水样本中的表达差异情况。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术提供了环状RNAhsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的新用途，可作为诊断试剂用于眼底血管性疾病的诊断，特别是增殖性糖尿病视网膜病变和湿性老年黄斑变性中的诊断和预后评估，可根据个体的circRNA表达水平进行眼底血管性疾病的诊断和病情发展的判断。本专利技术证明通过定量PCR技术，检测患者房水中hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的表达来实现眼底血管性疾病的早期诊断是完全可行的。本专利技术的试剂盒还适用于早期筛查：根据患者年龄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种眼底血管性疾病检测生物标记物，所述标记物为hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284，所述hsa_circ_0000615的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种眼底血管性疾病检测生物标记物，所述标记物为hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284，所述hsa_circ_0000615的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的眼底血管性疾病检测生物标记物，其特征在于：所述hsa_circ_0000615的检测引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；所述hsa_circ_0000284的检测引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。


3.一种眼底血管性疾病检测实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBRPremixExTaq2×，hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284特异性的qRT-PCR上游引物，hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284特异性的qRT-PCR下游引物；GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物。


4.根据权利要求3所述的一种眼底血管性疾病检测实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述hsa_circ_0000615或hsa_circ_000028...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜标，蒋沁，刘明，
申请(专利权)人：蒋沁，
类型：发明
国别省市：江苏;32