利用CRISPR-Cas9系统同时沉默番茄miR482b和miR482c及应用技术方案

本发明专利技术涉及番茄转基因材料的构建，旨在提供一种运用CRISPR‑Cas9系统同时沉默番茄miR482b和miR482c的基因编辑方法。包括：选择sgRNA靶位点进行克隆，将多个sgRNA表达框架构建到一个载体上，可用于真核表达；将重组质粒转化农杆菌，介导转化番茄愈伤组织获得转基因植株，发苗，获得转基因阳性株系；还提供了利用CRISPR‑Cas9系统同时沉默番茄miR482b和miR482c的应用方法，培育抗晚疫病番茄植株。本发明专利技术方法得到的转基因植株中miR482b和miR482c的表达量低于野生型植株，其抗晚疫病效果更优。本发明专利技术通过沉默miR482b和miR482c基因使番茄对晚疫病的抗性增强，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR-Cas9系统同时沉默番茄miR482b和miR482c及应用
本专利技术涉及番茄转基因材料的构建，具体涉及利用CRISPR-Cas9系统同时沉默miR482b和miR482c及应用。
技术介绍
番茄是一种世界范围内广泛种植的经济、园艺作物。在其生长过程中，由各种病原物引起的植物病害，严重影响了番茄的产量，造成了巨大的经济损失。近年来，晚疫病成为最严重的番茄病害之一，对农业生产及经济发展造成了重大损失。虽然化学农药对晚疫病的发生和蔓延有一定的控制作用，但由此引发的环境污染，病原菌抗药性等问题，依旧给农业生产带来了极大的困扰，因此，研究番茄抗病的分子机制，用生物学方法提高番茄对晚疫病的抗性成为了关键问题。miRNA一类短的、内源性的调控基因表达的单链RNA分子，其长度约为20-23个核苷酸。miRNA通过在转录和转录后水平调控靶基因的表达，在植物的生命过程中扮演了负调节因子的角色。已有大量研究表明miRNA在响应生物胁迫中发挥着重要的作用。例如，在水稻中，miR160a和miR398b的过表达增强了植物对稻瘟病菌的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用CRISPR-Cas9系统同时沉默番茄miR482b和miR482c的基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)根据CRISPR-Cas9技术的设计靶位点的原则，把第一个靶位点设计在MIR482b基因的过客链上，第二个靶点设计在MIR482b基因的成熟体序列上，第三个靶位点设计在MIR482c基因的过客链上，第四个靶点设计在MIR482c基因的成熟体序列上；/nsgRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；/n(2)人工合成AtU6启动子序列、Streptococcus pyogenes Cas9序列...

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR-Cas9系统同时沉默番茄miR482b和miR482c的基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据CRISPR-Cas9技术的设计靶位点的原则，把第一个靶位点设计在MIR482b基因的过客链上，第二个靶点设计在MIR482b基因的成熟体序列上，第三个靶位点设计在MIR482c基因的过客链上，第四个靶点设计在MIR482c基因的成熟体序列上；
sgRNA的核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示；
(2)人工合成AtU6启动子序列、StreptococcuspyogenesCas9序列；
(3)将sgRNA靶位点引物退火后形成的带有粘性末端的核心序列排列组装，与AtU6，35S，SpCas9片段一起构建于一个植物双元表达载体pBI121骨架载体上，获得以下载体骨架：AtU6：：sgRNA-35S：：SpCas9；
(4)获得完整的番茄CRISPR-Cas9编辑载体CR-mir482b,c。


2....

【专利技术属性】
技术研发人员：栾雨时，洪雨慧，贺晓丽，张媛媛，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21