本发明专利技术提供了一种靶向c‑Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR‑T细胞及应用，属于肿瘤治疗技术领域，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中的一种所示；所述嵌合抗原受体包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、所述的单链抗体、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区；所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体能够高特异性结合c‑Met抗原，以所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体修饰的T细胞可以高效靶向杀伤c‑Met高表达肿瘤细胞，在体内与体外均取得了较为理想的疗效。
【技术实现步骤摘要】
一种靶向c-Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR-T细胞及应用
本专利技术属于肿瘤治疗
，尤其涉及一种靶向c-Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR-T细胞及应用。
技术介绍
c-Met基因位于7号染色体(7q21-q31)上，由21个外显子和20个内含子构成，长度约为120kDa。c-Met初级转录本生成150kDa的多肽，然后部分糖基化形成170kDa的单链前体蛋白。该前体蛋白进一步糖基化形成由50kDa的胞外链(α链)与145kDa的跨膜链(β链)连结而成的约190kDa的异二聚体(MaulikG,ShrikhandeA,KijimaT,etal.Roleofthehepatocytegrowthfactorreceptor,c-Met,inoncogenesisandpotentialfortherapeuticinhibition.CytokineGrowthFactorRev,2002,13(1):41-59.；SattlerM,MaPC,SalgiaR.TherapeutictargetingofthereceptortyrosinekinaseMet.CancerTreatRes,2004,119:121-138.)。跨膜链(β链)包括SEMA结构域(semahomologyregion,SEMA)、PSI结构域(plexinsemaphorin-integrin,PSI)、4个免疫球蛋白样重复结构域(immunoglobulin-likeregionsinplexinsandtranscriptionfactors,IPT)、一个跨膜域、一个近膜域(juxtamembranedomain,JM)、酪氨酸激酶结构域(tyrosinekinase,TK)和一个羧基末端的尾部区域(Carboxylterminal,CT)。其中SEMA结构域是配体结合的重要元素之一，被认为是HGF的结合位点，而PSI结构域的功能是使c-Met的胞外片段很好地与配体结合。近膜域(JM)包含两个蛋白磷酸化位点：S985和Y1003。S985位点发生磷酸化可负调控激酶活性，Y1003残基磷酸化后与c-Cbl结合。c-Cbl是一种E3泛素连接酶，可以通过指环结构域与E2泛素结合酶结合，进而支配细胞内摄并最终导致底物泛素化和降解。酪氨酸激酶结构域活化位点Y1230、Y1234和Y1235的磷酸化促进酪氨酸激酶的激活。c-Met与HGF结合后，c-Met的活化残基Y1234和Y1235发生磷酸化，进而招募胞内SH2结构域(Srchomology-2,SH2)和其他特异的信号效应分子激活下游信号通路(CecchiF,RabeDC,BottaroDP.TargetingtheHGF/Metsignalingpathwayincancertherapy.ExpertOpinTherTargets,2012,16(6):553-572.)。c-Met除了参与调节正常细胞粘附、分化和迁移外，也参与细胞的恶性转化。HGF激活的c-Met受体与细胞内的一些靶蛋白直接作用，可激活包括Ras/MAPK和PI3K/PKB等信号转导的各级联途径，调节多种恶性肿瘤细胞的增殖分化、形态变化和运动侵袭等，从而促进肿瘤的浸润与转移。多项研究表明，c-Met异常表达与多种肿瘤的发生、发展和转移密切相关。CAR-T，即嵌合抗原受体修饰的T细胞，是一种通过体外基因编辑技术将CAR基因稳定整合至基因组的人T淋巴细胞。CAR-T联合了抗体的靶向作用和T淋巴细胞的效应功能，以非MHC限制性方式高特异性识别靶抗原从而杀伤肿瘤细胞。目前，CAR-T在血液癌症治疗方面取得了突破性的进展，先后有两款靶向CD19的CAR-T细胞产品上市。但对于实体瘤来说，由于肿瘤微环境等因素的限制，影响了CAR-T的应用效果，各国科学家都在试图解决此项难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种靶向c-Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR-T细胞及应用；所述靶向c-Met的嵌合抗原受体能够高特异性结合c-Met抗原，以所述靶向c-Met的嵌合抗原受体修饰的T细胞可以高效靶向杀伤c-Met高表达肿瘤细胞，在体内与体外均取得了较为理想的疗效。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种靶向c-Met的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中的一种所示。本专利技术提供了编码所述的单链抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4～SEQIDNo.6中的一种所示。本专利技术提供了一种靶向c-Met的嵌合抗原受体，包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、单链抗体、CD8a铰链区-跨膜区、4-1BB功能区和CD3功能区。优选的，所述单链抗体由铰链连接抗体轻链可变区和抗体重链可变区组合而成。优选的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.7～SEQIDNo.9中的一种所示。本专利技术提供了编码所述的嵌合抗原受体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.10～SEQIDNo.12中的一种所示。本专利技术提供了一种靶向c-Met的重组载体，包括所述的嵌合抗原受体的基因和初始载体。优选的，所述初始载体为慢病毒载体。本专利技术提供了一种靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞，由所述的靶向c-Met的重组载体转染T细胞获得。本专利技术提供了所述的单链抗体、编码所述单链抗体的基因、所述的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的基因、所述的重组载体、所述的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的靶向c-Met的单链抗体，分别为2A45、2D81和3D88，与c-Met抗原有极强的结合能力，和对照抗原、细胞裂解液无显著结合；对c-Met抗原有很好的特异性靶向功能。本专利技术制备的靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞，均对c-Met阳性的H1299细胞有较为强烈的杀伤作用，而对照细胞Mock-T则无杀伤，其中2D81CAR-T细胞展示了最强的杀伤效果，相比positivecontrolCAR-T，2D81CAR-T细胞分泌IFN-γ、TNF等增强T细胞活性的细胞因子的能力显著增强，且2D81CAR-T细胞比positivecontrolCAR-T分泌更少的IL-10(IL-10起免疫抑制作用)，2D81CAR-T显著延长了荷瘤小鼠的生存期，生理盐水组小鼠在42天时全部死亡，Mock-T组小鼠在47天时全部死亡，而2D81CAR-T组小鼠在实验终点55天时依然有40％小鼠存活，可见2D81CAR-T细胞对c-Met阳性肿瘤有很好的抑癌效果。附图说明图1为ELISA检测结果；图2为CAR质粒图谱；图3为酶切电泳结果；图4为CAR表达率流式检测结果；图5为CAR-T细胞对c-Met阳性细胞H1299杀伤效果检测结果；图6为2D81CAR-T细胞中细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向c-Met的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.3中的一种所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种靶向c-Met的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中的一种所示。
2.编码权利要求1所述的单链抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4～SEQIDNo.6中的一种所示。
3.一种靶向c-Met的嵌合抗原受体，其特征在于，包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、权利要求1所述的单链抗体、CD8a铰链区-跨膜区、4-1BB功能区和CD3功能区。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述单链抗体由铰链连接抗体轻链可变区和抗体重链可变区组合而成。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.7～SEQIDNo.9中的一种所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，陈静远，梁皓，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，焦顺昌，
类型：发明
国别省市：北京;11
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