基于杂交链式反应的免疫信号放大方法技术

本发明专利技术提供了一种基于抗体的生物分析方法，特别是一种用于放大免疫信号的基于杂交链式反应的方法，被称为免疫信号HCR(isHCR)，其将抗体‑抗原相互作用与杂交链式反应(HCR)技术相结合来放大免疫信号。本发明专利技术还提供了一种用于执行上述isHCR的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于杂交链式反应的免疫信号放大方法
技术介绍
由于基于抗体的免疫测定的易于使用、速度和成本效益，它们一直是检测和鉴定蛋白质和其它生物分子在生物样品中的位置的最流行的方法。这些方法使用与目标分子(抗原)选择性结合的第一抗体，并且这种抗体-抗原相互作用可通过可识别第一抗体-表位复合物并与之反应的偶联的报道分子或标记的第二抗体而被可视化(Han，K.N.，Li，C.A.&Seong，G.H.Annu.Rev.Anal.Chem.6，119–141(2013))。使用免疫测定时的主要限制是样品中给定目标分子的低丰度往往需要先进行信号放大然后才可能检测。可以使用催化生色底物在目标复合物上沉积的偶联的酶例如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶等来实现放大(Bobrow，M.N.，Harris，T.D.，Shaughnessy，K.J.&Litt，G.J.J.Immunol.Methods125，279–285(1989))。已开发出荧光底物，尤其是基于HRP-酪胺反应化学的荧光底物，来支持高分辨率荧光显微术(Stack，E.C.，Wang，C.，Roman，K.A.&Hoyt，C.C.Methods70，46–58(2014))。虽然现行的放大方法非常有用且被广泛采用，但它们有几个缺点：它们经常产生高本底，它们可由于染料扩散而降低空间分辨率，它们难以用于同时检测多个放大的信号(Carvajal-Hausdorf，D.E.，Schalper，K.A.，Neumeister，V.M.&Rimm，D.L.Lab.Invest.95，385–396(2015))，而且它们不适合用于几种强大的新型组织膨胀和透明化技术中的大体积样品。在本专利技术中，我们发现无酶放大途径能够克服这些限制中的许多种。特别是杂交链式反应(HCR)技术适于放大免疫信号。HCR，其根据在自组装为聚合物的DNA发夹寡聚体集之间发生的识别和杂交事件，迄今主要用于放大来自原位杂交样品的mRNA信号(Choi，H.M.T.，Beck，V.A.&Pierce，N.A.ACSNano8，4284–4294(2014)；Shah，S.等人Development143，2862–2867(2016))，并且最近用于检测蛋白质-蛋白质相互作用(Koos，B.等人Nat.Commun.6，7294(2015))。在典型的使用情况下，与目标mRNA分子互补的核酸探针被用作‘引发链’寡核苷酸。从引发链寡核苷酸开始，使用一系列聚合反应将荧光团标记的核酸‘放大链’寡核苷酸添加到目标mRNA-引发链复合物中；然后将荧光团可视化。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于抗体的生物分析方法，具体而言是一种称为免疫信号HCR(isHCR)的方法，所述方法将抗体-抗原相互作用与杂交链式反应(HCR)技术相结合。本专利技术还提供了一种用于执行上述isHCR的试剂盒。本专利技术进一步提供了一种基于抗体的生物分析方法，具体而言是一种称为多轮式免疫信号HCR(isHCR)的方法(多轮式isHCR)，所述方法将抗体-抗原相互作用与杂交链式反应(HCR)相结合，其中使用了多轮放大以使HCR聚合物分支和生长。相应地，本专利技术也提供了一种用于执行多轮式isHCR的试剂盒。在第一方面，本专利技术提供了一种isHCR方法，所述方法包括将HCR引发链与分析物特异性的抗体(包括但不限于传统的IgG和纳米抗体)偶联，并添加一对放大链以进行杂交链式反应。在第二方面，本专利技术提供了一种用于执行所述isHCR方法的试剂盒，所述试剂盒包含(1)分析物特异性的抗体；(a)HCR引发链(HCRinitiator)；和(3)一对HCR放大链(HCRamplifiers)，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联所述抗体的区域。在第三方面，本专利技术提供了一种HCR引发链，所述引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联待分析的分析物特异性的抗体的区域。在第四方面，本专利技术提供了一种待分析的分析物特异性的抗体，所述抗体直接或间接地与HCR引发链偶联。所述HCR引发链可以与几种类型的自组装型DNAHCR放大链中的任何一种杂交，所述放大链包括可用于使原始目标信号可视化的荧光团标记的放大链寡核苷酸。所述放大链是带荧光标签的放大链或生物素化的HCR放大链。HCR引发链利用许多相互作用与抗体偶联，所述相互作用例如链霉亲和素-生物素相互作用、共价键相互作用(化学接头，例如，胺反应性接头、硫醇反应性接头或点击化学接头)等。胺反应性接头可以是含有琥珀酰亚胺酯基团的接头。硫醇反应性接头可以是含有马来酰亚胺基团的接头。点击化学接头可以是含有点击化学官能团的接头，例如NHS-叠氮化物接头、NHS-DBCO接头、马来酰亚胺-叠氮化物接头或马来酰亚胺-DBCO接头。优选地，所述HCR引发链是生物素化的引发链，它能够与链霉亲和素的空位结合位点相连，而链霉亲和素能够与生物素化的抗体相连，从而使所述HCR引发链与所述抗体偶联。优选地，在本专利技术isHCR方法中使用的HCR引发链和放大链(H1和H2)可以被末端修饰或内部修饰以改善信号强度或作为进入其它化学反应的界面。本专利技术isHCR方法中使用的HCR引发链和放大链(H1和H2)可以用化学基团和/或荧光染料进行末端修饰或内部修饰。例如，本专利技术isHCR方法中使用的HCR引发链和放大链(H1和H2)可以用生物素、acrydite、胺、硫醇、DBCO和/或荧光染料进行末端修饰和/或内部修饰。荧光染料可以是FITC、花青染料、AlexaFluors、Dylightfluors、Atto染料或JaneliaFluor染料。优选地，所述isHCR方法使用生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，其中DNA-生物素HCR引发链与生物素化抗体相连并进而触发标记的HCR放大链自组装成聚合物。例如，所述标记的HCR放大链是荧光团标记的HCR放大链。所述isHCR方法使用无标记的链霉亲和素，这允许合成的5’-生物素化的DNAHCR引发链与链霉亲和素的空位结合位点相位，链霉亲和素又与生物素化抗体相连。所述生物素化抗体可以是与目标抗原特异性的第一抗体反应的生物素化第二抗体。优选地，本专利技术提供了一种试剂盒，其包含：(1)分析物特异性的生物素化抗体；(2)链霉亲和素；(3)生物素化的引发链；以及(4)一对HCR放大链。本专利技术isHCR方法或试剂盒可用于在不同亚细胞位置(例如，细胞膜和囊泡膜、胞质溶胶、线粒体和细胞核)处以及在各种类型的样品(例如，印迹、培养细胞、组织切片和整个器官)中强有力地放大免疫信号。因此，所述isHCR方法可用于分析生物样品中的分析物。特别是，本专利技术isHCR方法可用于实验室、临床或诊断应用，尤其是现场应用，例如临床位点护理。所述isHCR方法在需要灵敏检测免疫信号的应用中尤其有用。我们在此证明了它在用单克隆抗体放大免疫信号中、及在检测丰度极低的易位细菌效应子信号中的用途，以及其它应用。isHCR的实际放大性能取决于特定的应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫信号杂交链式反应(isHCR)，其包括将杂交链式反应(HCR)引发链与分析物特异性的抗体偶联，并添加一对HCR放大链以进行杂交链式反应。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种免疫信号杂交链式反应(isHCR)，其包括将杂交链式反应(HCR)引发链与分析物特异性的抗体偶联，并添加一对HCR放大链以进行杂交链式反应。


2.根据权利要求1所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联分析物特异性的抗体的区域。


3.根据权利要求1或2所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链和/或所述放大链用生物素、acrydite、胺、硫醇、DBCO和/或荧光染料进行末端修饰和/或内部修饰，并且所述荧光染料选自FITC、花青染料、Dylightfluors、Atto染料、JaneliaFluor染料、AlexaFluro546、AlexaFluor488和AlexaFluor647。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链通过选自链霉亲和素-生物素相互作用和共价键相互作用的相互作用与抗体偶联。


5.根据权利要求4所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链是生物素化的引发链，它能够与链霉亲和素的空位结合位点相连，链霉亲和素能够与生物素化的抗体相连，从而使所述HCR引发链与所述抗体偶联。


6.根据权利要求4所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述共价键相互作用是通过选自含有琥珀酰亚胺酯基团的胺反应性接头和点击化学接头的化学接头的相互作用。


7.根据权利要求6所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述点击化学接头选自NHS-叠氮化物接头、NHS-DBCO接头、马来酰亚胺-叠氮化物接头和马来酰亚胺-DBCO接头。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长。


9.根据权利要求8所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述放大链或所述放大链对用化学基团和/或荧光染料进行末端修饰或内部修饰，这允许引发更多轮的放大，所述化学基团选自生物素、洋地黄毒苷、acrydite、胺、琥珀酰亚胺酯、硫醇、叠氮化物、TCO、四嗪、炔烃和/或DBCO，并且所述荧光染料选自FITC、花青染料、Dylightfluors、Atto染料、JaneliaFluor染料、AlexaFluro546、AlexaFluor488和AlexaFluor647。


10.根据权利要求8或9所述的免疫信号杂交链式反应，其中将一对带荧光团标签的放大链添加到所述多轮式isHCR的最后一轮中以进行可视化。


11.根据权利要求8-10中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述放大链在内部位置被修饰，其更易于接近链霉亲和素并充当多轮式isHCR中每个连续的分支轮的锚点。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述抗体是与分析物特异性的第一抗体发生反应的第二抗体，所述第二抗体是IgG或纳米抗体，并且所述第一抗体是IgG、纳米抗体或scFv。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其还包括使用氧化石墨烯(GO)以吸收未组装的HCR放大链。


14.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其还包括使用氧化石墨烯(GO)以吸收未组装的HCR放大链并猝灭荧光，其中所述放大链被荧光染料末端修饰和/或内部修饰。


15.根据权利要求13或14所述的免疫信号杂交链式反应，其中GO的粒度<500nm。


16.一种用于免疫信号杂交链式反应(isHCR)的试剂盒，所述试剂盒包含：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：林睿，罗敏敏，
申请(专利权)人：北京生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11