一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用技术

本发明专利技术属于生物饲料领域，涉及种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质纤维素降解中的应用；首先将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列进行偏爱性优化，以优化的基因为模板进行PCR扩增，与pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得重组穿梭质粒并导入缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌；培养后得到粗酶液，与中草药混合，再加入氯化钙、硫酸锰、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解反应；本发明专利技术提供的方法可以快速地获取大量锰过氧化物酶，实现锰过氧化物酶的工业化生产，制备良好稳定的过氧化物酶产品，实现中草药木质素的有效降解。

【技术实现步骤摘要】
一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用
本专利技术属于生物饲料领域，具体涉及一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用。
技术介绍
食品安全和大健康产业是今后的发展方向，养殖业是其重要的前提条件。近年来化学合成添加剂、抗生素和激素使得畜禽产品的品质、口感、营养及安全性备受质疑，高品质的饲料成为刚需。中华人民共和国农村农业部发布第194号公告，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。中草药饲料添加剂将得到推广，畜禽饲料中添加中草药，有效发挥防病治病的效果，而且纯天然、毒副作用小、低残留、高安全性。比如，杜仲中含有丰富的绿原酸，有保胎安胎之功效；黄芪中含有丰富的黄芪多糖等，能显著提高免疫力。当下使用的中草药中有90％为植物类，而植物细胞内物质均被致密木质纤维素包裹，致使胞浆中有效成分和活性物质难以充分释放。在中草药发酵过程中加入多种纤维素酶、半纤维素酶可以降解细胞壁间组分物质，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障作用，促进中草药有效物质向提取介质中扩散，提高活性物质的溶出率。减少煎、煮、熬、炼、蒸、浸等传统工艺中芳香类挥发油、维生素等对热敏感的活性成分的破坏，最大限度提取中草药活性成分或转化原成分，生成新组分，分解毒性物质。但是，木质素包被在纤维素的外层，这种紧密的网络结构能够阻碍酶与纤维素的接触，尤其在木本中草药中含有大量的木质素，直接影响发酵效果和有效物质的溶出率，所以中草药中木质素的降解就变得十分有必要。合适的木质素降解方式可以提高孔隙率，扩大纤维素酶和半纤维素酶与底物之间相互作用区域。木质素的降解依靠木质素降解酶，其中重要的酶有木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)、多功能酶(VP)以及其他协同酶。黄孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium降解木质素的能力被发现以来，陆续开展了很多有关白腐真菌降解木质素的研究。白囊耙齿菌(Irpexlacteus，Genbank登录号GCA_001986395.2)，又名乳白耙齿菌，基因组分析显示Irpexlacteus有一整套木质素降解酶系统，可以产生木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶。其中锰过氧化物酶，既可以氧化木质素中的酚类结构单元又可以氧化非酚类的结构单元，是一种高效的木质素降解酶。但是由于真菌产酶的速度很慢，降解木质素过程中发酵时间长从而增加生产成本，限制了的工业上的应用推广。目前，市场上还没有商品化的锰过氧化物酶酶制剂，中草药提取或发酵过程中较重视纤维素酶法预处理，以木质素为突破口的工艺报道很少，尤其在发酵过程中联合多种木质素降解酶系、纤维素酶系、半纤维素酶系协同及离子、小分子物质复配促进的报道更加缺乏。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于克服现有中草药提取或发酵技术中的问题，提供一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质纤维素降解中的应用。本专利技术公开的重组锰过氧化物酶的制备方法可以快速地获取大量锰过氧化物酶产物，实现锰过氧化物酶的工业化生产，获得良好稳定的锰过氧化物酶酶制剂，用于木质素的降解，尤其对木本中草药中木质纤维素的降解具有较好的降解效率。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取的技术方案为：(1)将来源于Irpexlacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；(3)培养步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；得到的菌液以不同的方式制备保存、备用；优选的，步骤(2)中所述重组穿梭质粒为pREP-mnp。优选的，步骤(2)中所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，无抗性基因，具有生物安全性。优选的，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，具有生物安全性的食品级酵母菌。优选的，步骤(3)中所述菌液以不同的方式制备保存为：直接保存菌液、或菌液固液分离后保存液体部分(即粗酶液)、或由粗酶液制备的浓缩制剂和粉制剂进行保存；所述的固液分离的方式包括高速碟式离心机或板框过滤。重组锰过氧化物酶用于降解木本中草药木质素的用途：取步骤(3)制备的菌液或菌液分离后的粗酶液与中草药混合，并添加CaCl2、MnSO4、漆酶、葡萄糖氧化酶、复合酶系和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解反应，降解木本中草药木质素。优选的，所述的粗酶液的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～5.0。优选的，所述中草药与菌液或粗酶液的质量比为(1～5):1。优选的，所述菌液或粗酶液中锰过氧化物酶的酶活力为15～20U/L。优选的，所述CaCl2的用量为中草药质量的0.1％～2％；所述MnSO4的用量为中草药质量的0.1％～0.9％，葡萄糖氧化酶的用量为中草药质量的0.2％～1％，漆酶的用量为中草药质量的0.1％～2％，复合酶系的用量为中草药质量的0.1％～5％。优选的，所述复合酶系由酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶组成。所述酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶质量比为2:2:2:2:1:1；所述酸性纤维素酶的酶活为10000U/g，纤维二糖酶的酶活为10000U/g，甘露聚糖酶的酶活为10000U/g，木聚糖酶的酶活为180000U/g，果胶酶的酶活为50000U/g，β-葡聚糖酶的酶活为50000U/g。优选的，所述小分子物质激活剂由草酸和Tween-80组成；菌液或粗酶液中草酸终浓度0.2～1mM；复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为中草药质量的0.02％。优选的，所述酶解反应的温度为30～40℃，酶解时间为5～72h。优选的，所述菌液或粗酶液与中草药混合，其中中草药具体为中草药干粉。优选的，所述中草药具体为黄芪或杜仲。本专利技术制备的锰过氧化物酶浓缩制剂可应用于新鲜中草药湿料，具体步骤如下：将重组锰过氧化物酶酵母工程菌置于发酵罐中培养，得到菌液后，通过高速碟式离心机固液分离后收集液体部分，即为粗酶液，再通过超滤浓缩-乙醇沉淀，收集乙醇沉淀后的蛋白，晾干后得到锰过氧化物酶浓缩剂。优选的，所述的发酵罐为瑞典比欧3.7L微型发酵罐；发酵温度为30℃，转速为220rpm，时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：/n(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；/n(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；/n(3)培养步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；得到的菌液以不同的方式制备保存、备用。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将来源于Irpexlacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；
(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；
(3)培养步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；得到的菌液以不同的方式制备保存、备用。


2.根据权利要求1所述的重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组穿梭质粒为pREP-mnp；所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌。


3.根据权利要求1所述的重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母。


4.根据权利要求1所述的重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述菌液以不同的方式制备保存为：直接保存菌液或菌液固液分离后保存液体部分，即粗酶液；或由粗酶液制备成浓缩制剂和粉制剂进行保存。


5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法制备的重组锰过氧化物酶用于降解中草药木质素的用途，其特征在于，步骤如下：取菌液或菌液分离后的粗酶液与中草药混合，并添加CaCl2、MnSO4、漆酶、...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华友，崔周磊，王洪成，卢晨曦，姚丹，陈华撑，
申请(专利权)人：浙江康星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33