一种能降解黄曲霉毒素B制造技术

本发明专利技术公开了一种能降解黄曲霉毒素B

A degradation of aflatoxin B

【技术实现步骤摘要】
一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶及其应用
本专利技术涉及一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶，属于生物技术和基因工程

技术介绍
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉、寄生曲霉等多种真菌产生的有毒次级代谢产物，黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知黄曲霉毒素家族中毒性最大的，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，对人和家畜的健康产生极大的威胁。因此在食品、饲料等行业中，黄曲霉毒素B1的脱毒和降解显得尤为重要。传统的黄曲霉毒素的脱毒方式有物理和化学方法。物理方法主要包括高温法、辐射法和物理吸附法。其中，采用高温法要加热至300℃才能使黄曲霉毒素B1有明显的分解，成本太高；辐射法存在辐照技术本身的放射性污染问题，辐射机理的认知不全，辐照对食物、饲料的安全性问题使辐射除毒技术的应用受到限制。化学法主要包括碱处理法和氧化法，但化学法本身存在不稳定性，在碱性条件下，黄曲霉毒素B1的内酯环被打开，变成了香豆素钠盐或铵盐，黄曲霉毒素毒性消失，但从碱性恢复到中性时，打开的内酯环会重新连接成毒素。其次，化学法安全性有待于评估，对产品的其他成分也有一定程度的破坏。黄曲霉毒素B1的生物脱毒主要是利用微生物或其产生的酶及其制剂通过生物催化的方法脱毒，与物理、化学方法相比，生物脱毒条件相对温和且高效，产品的品质得以保证，甚至有些益生菌还能提升产品的营养价值。已知锰过氧化物酶家族具有降解芳香族化合物的特殊能力，因此其在纸浆的生物漂白、褐煤的生物降解、农业废弃物的处理、有机污染物的降解等工业和农业应用方面有重要作用。例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)来源的锰过氧化物酶，在之前的研究报道中主要应用于降解木质素领域，但从未发现其具有降解黄曲霉毒素的作用。另外，目前有在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)以及大肠杆菌(Escherichiacoli)中成功异源表达不同来源的锰过氧化物酶的报道，但是巴斯德毕赤酵母表达系统易分泌产生有害代谢产物，且需要利用有害化学物质甲醇进行诱导表达，并不适合应用于食品、谷物加工、农业等领域；而大肠杆菌本身就是致病菌的一种，当使用大肠杆菌作为表达宿主时，还会导致锰过氧化物酶蛋白不能够正确折叠，从而以没有活性的包涵体形式存在，需要繁琐的重折叠过程使酶恢复活性，实验操作繁杂且成本高，也不适合应用于食品、谷物加工、农业等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种锰过氧化物酶在降解黄曲霉毒素B1中的应用，所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：(a)具有NCBIProtein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，所述降解是在pH3.0～pH5.5，25℃～45℃下反应30h～60h。在本专利技术的一种实施方式中，所述降解的反应体系中，MnSO4浓度为0.25μmol/μg～1.75μmol/μg黄曲霉毒素B1，锰过氧化物酶的添加量为1.0mg/μg～4.0mg/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖的添加量为0.5μmol/μg～3.0μmol/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖氧化酶的添加量为0.25U/μg～1.5U/μg黄曲霉毒素B1。在本专利技术的一种实施方式中，所述锰过氧化物酶包括发酵表达锰过氧化物酶的细胞所得的含锰过氧化物的发酵上清液。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括乳酸克鲁维酵母。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达锰过氧化物酶的细胞包括重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，所述重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP是以食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799为表达宿主，以食品安全级质粒pKLAC1质粒为表达载体，表达锰过氧化物酶的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵上清液是将重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP接种于YPD培养基中，在28℃～32℃，200rpm～220rpm下培养15h～20h后以1％～5％接种量(V/V)转接至YPG培养基中，在28℃～32℃，200rpm～220rpm恒温发酵60h～80h；发酵结束后，离心，收集上清液得到的发酵上清液。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述锰过氧化物酶的基因的核苷酸序列如NCBIGene-ID为L29039.1的核苷酸序列所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括用于降解食品、谷物或饲料中的黄曲霉毒素B1。本专利技术的目的还在于提供一种重组乳酸克鲁维酵母，其表达锰过氧化物酶；所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：(a)具有NCBIProtein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组乳酸克鲁维酵母以食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799为表达宿主，以食品安全级质粒pKLAC1质粒为表达载体。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术发现Phanerochaetechrysosporium来源的锰过氧化物酶具有降解黄曲霉毒素B1的作用，并且以乳酸克鲁维酵母为宿主，构建了表达Phanerochaetechrysosporium来源的锰过氧化物酶的食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，应用该重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP发酵得到的发酵上清液在pH4.5、40℃条件下降解黄曲霉毒素B140h，对黄曲霉毒素B1的降解率达75.7％；(2)本专利技术构建了食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，该菌株能够将锰过氧化物酶直接分泌到发酵上清液中，发酵上清液可用于降解黄曲霉毒素B1，表达产物直接分泌到发酵上清液中，和现有技术中以大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母作为表达宿主表达锰过氧化物酶相比，具有不需要经过重折叠等过程、步骤简单、成本低、无需使用有害诱导物、安全性高等优点，适宜在食品工业大规模应用。附图说明图1：蛋白电泳结果，其中，泳道1是乳酸克鲁维酵母GG799的发酵培养物无细胞提取液；泳道2是乳酸克鲁维酵母GG799的细胞破碎沉淀物；泳道3是乳酸克鲁维酵母GG799的发酵上清液；泳道4是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵培养物无细胞提取液；泳道5是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的细胞破碎沉淀物；泳道6是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液。M为分子量标准(单位：kDa)。具体实施方式1、培养基(1)YPD固体培养基：1.0％酵母粉，2.0％蛋白胨，2.0％葡萄糖，2.0％琼脂粉。(2)YPD液体培养基：1.0％酵母粉，2.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锰过氧化物酶在降解黄曲霉毒素B

【技术特征摘要】
1.一种锰过氧化物酶在降解黄曲霉毒素B1中的应用，其特征在于，所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：
(a)具有NCBIProtein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；
(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降解是在pH3.0～pH5.5，25℃～45℃下反应30h～60h。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降解的反应体系中，MnSO4浓度为0.25μmol/μg～1.75μmol/μg黄曲霉毒素B1，锰过氧化物酶的添加量为1.0mg/μg～4.0mg/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖的添加量为0.5μmol/μg～3.0μmol/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖氧化酶的添加量为0.25U/μg～1.5U/μg黄曲霉毒素B1。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述锰过氧化物酶包括表达锰过氧化物酶的细胞发酵所得的含锰过氧化物酶的发酵上清液。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞的宿主包括食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。


6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述表达锰过氧化物酶的细胞包括重组乳酸克鲁维酵母GG799/p...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏雨，孙莹，吴梓凤，吴世嘉，刘祖河，刘琦，王周平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32