一种提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高粗毛栓菌(Trametes hirsuta)木质素过氧化物酶产量的方法，将预培养的粗毛栓菌按6‑9％(v/v)的接种量接种到基础产酶培养基中，并在温度30℃‑40℃、pH 5‑7、转速140‑180rpm的条件下进行发酵培养。利用本发明专利技术的方法，木质素过氧化物酶酶活比未优化前提高322.89％，酶产量比未优化前提高321.43％。本发明专利技术的方法操作简单，易于放大生产，适于大规模木质素过氧化物酶发酵，从而降低木质素过氧化物酶生产成本，满足规模化应用的要求。

A method to increase the production of ligninoperoxidase of Chaetomium hirsutum

【技术实现步骤摘要】
一种提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种提高粗毛栓菌(Trameteshirsuta)木质素过氧化物酶产量的方法。
技术介绍
木质素过氧化物酶(Ligninperoxidase，Lip)是由白腐菌分泌的主要胞外酶之一，它是一种含亚铁红血素的过氧化物酶，最早是在金孢展齿革菌(Phanerochaetechrysosporium)中发现的，木质素过氧化物酶的活性中间体具有比其它过氧化物酶更高的氧化潜能，能够氧化苯酚、芳香胺、芳香醚、甲氧基芳香环和多环芳香化合物等物质，进而能够有效降解木质素，去除多种有毒物质，且由于其氧化生成的产物不污染环境，因此在食品、造纸、环境保护及其它领域具有很大的研究价值和应用潜力。粗毛栓菌作为白腐菌的一员，相比于香菇(Lentinula)、侧耳菌(Pleurotus)、平革菌(Phanerochaete)等真菌，具有较强的产木质素过氧化物酶能力，可作为生物制浆、纸浆漂白、环境保护等方面的理想菌株。但是其木质素过氧化物酶产量低导致其生产和应用成本较高，难以满足工业化生产的需要。因此，低成本高产量成为木质素过氧化物酶生产研究的主要目的。目前提高木质素过氧化物酶酶产量常用的方法是筛选高产菌株及木质素过氧化物酶基因的克隆和异源表达。高产菌株的获得周期长、效率低，木质素过氧化物酶基因的克隆和异源表达涉及基因工程改造，工作难度大，但通过对木质素过氧化物酶发酵培养基的温度、pH、转速和接种量等条件进行优化，不仅操作简单、成本低、周期短，还能够提高木质素过氧化物酶产量，这在一定程度上为工业化生产奠定了基础。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法。该方法能够大幅提高粗毛栓菌的木质素过氧化物酶产量，且操作简单，易于扩大生产，适于大规模木质素过氧化物酶发酵，从而降低木质素过氧化物酶生产成本，满足规模化应用的要求。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种提高粗毛栓菌产木质素过氧化物酶的方法，所述方法包括以下步骤：1)将粗毛栓菌活化和预培养，2)将预培养的粗毛栓菌接种到基础产酶培养基中，并在温度30℃-40℃、pH5-7、转速140-180rpm的条件下进行发酵培养，接种量按体积计为所述培养基体积的6-9％(v/v)，和3)培养至发酵液中木质素过氧化物酶酶活达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。在本专利技术的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，活化包括：将粗毛栓菌接种到PDA固体培养基上，于25℃-30℃培养3-5天。在本专利技术的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，预培养包括将活化的粗毛栓菌菌丝接种到PDA液体培养基中，于25℃-30℃、120rpm条件下培养3-5天，混匀后按5％(v/v)的接种量接入新的PDA液体培养基中，培养3天，即得预培养的菌丝体。在本专利技术的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，基础产酶培养基包含：木质素2-4g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，蛋白胨1g/L，MnSO4·H2O0.0016g/L，ZnSO40.0014g/L，CoCl20.002g/L。。在本专利技术方法优选的实施方案中，基础产酶培养基包含3g/L木质素。在本专利技术的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，在步骤2)中，按基础产酶培养基的体积计，接种量为7.58％(v/v)，且发酵培养在pH5.72、温度34.6℃、转速160rpm的条件下进行。与现有技术相比，本专利技术具有突出的有益技术效果。借由上述技术方案可知，本专利技术的有益技术效果至少包括：本专利技术通过优化木质素的浓度、发酵温度、发酵初始pH、发酵转速和接种量等条件可有效提高粗毛栓菌的木质素过氧化物酶酶活和酶产量，利用本专利技术的方法可将木质素过氧化物酶酶活提高322.89％，酶产量提高321.43％。本方法操作简单、能耗小、污染低，易于扩大生产，适于大规模木质素过氧化物酶发酵，从而降低木质素过氧化物酶生产成本，满足规模化应用的要求。附图说明图1显示了未优化前粗毛栓菌木质素过氧化物酶酶活。图2显示了木质素浓度对产木质素过氧化物酶的影响。图3显示了pH对产木质素过氧化物酶的影响。图4显示了温度对产木质素过氧化物酶的影响。图5显示了转速对产木质素过氧化物酶的影响。图6显示了接种量对产木质素过氧化物酶的影响。图7显示了pH与温度对木质素过氧化物酶酶活交互影响的等高线图和曲面图。图8显示了pH与接种量对木质素过氧化物酶酶活交互影响的等高线图和曲面图。图9显示了温度与接种量对木质素过氧化物酶酶活交互影响的等高线图和曲面图。具体实施方式下面将结合具体实施方案对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作，其中粗毛栓菌(Trameteshirsuta)为保藏于湖北省武汉市武昌区中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的粗毛栓菌，保藏编号CCTCCM20191095。在粗毛栓菌发酵培养过程中用到如下培养基：PDA固体培养基：配制方法为，称量去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g。将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1L，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯残渣，加入葡萄糖、琼脂，再加入适量的水补充至1L。PDA液体培养基：与上述PDA固体培养基不同之处在于，PDA液体培养基中未添加琼脂。基础产酶培养基：木质素2g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，蛋白胨1g，MnSO4·H2O0.0016g，ZnSO40.0014g，CoCl20.002g，蒸馏水1L，pH约为7。上述基础产酶培养基为在张年磊等(张年磊，付广义，许友泽，陈跃辉.Aspergillussp.F-1降解水溶性木质素的研究[J].环境科学与技术，2019，42(02)：44-50.)报道的培养基的基础上进行改良而获得的培养基。实施例11.粗毛栓菌的活化与预培养(1)活化将粗毛栓菌(CCTCCM20191095)接种到PDA固体培养基上，于25℃-30℃培养3-5天。(2)预培养挑取步骤(1)中的粗毛栓菌菌丝体接种到装有100mLPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，于25℃-30℃、120rpm条件下培养3-5天。混匀后按5％(v/v)的接种量接入新的装有100mLPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，培养3天，即得预培养的菌丝体，用于接种到基础产酶培养基中进行木质素过氧化物酶发酵。以后实施例中均用250mL锥形瓶，装液量均为100mL，x％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高粗毛栓菌(Trametes hirsuta)木质素过氧化物酶产量的方法，所述方法包括以下步骤：/n1)将粗毛栓菌活化和预培养，/n2)将预培养的粗毛栓菌接种到基础产酶培养基中，在温度30℃-40℃、pH 5-7、转速140-180rpm的条件下进行发酵培养，接种量为所述培养基体积的6-9％(v/v)，和/n3)培养至发酵液中木质素过氧化物酶酶活达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高粗毛栓菌(Trameteshirsuta)木质素过氧化物酶产量的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将粗毛栓菌活化和预培养，
2)将预培养的粗毛栓菌接种到基础产酶培养基中，在温度30℃-40℃、pH5-7、转速140-180rpm的条件下进行发酵培养，接种量为所述培养基体积的6-9％(v/v)，和
3)培养至发酵液中木质素过氧化物酶酶活达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。


2.根据权利要求1所述的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法，所述活化包括：将粗毛栓菌接种到PDA固体培养基上，于25℃-30℃培养3-5天。


3.根据权利要求2所述的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法，所述预培养为将活化的粗毛栓菌菌丝体接种PDA液体培养基中，于25℃-30℃、120rpm条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟东，李灵灵，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23