根据本发明专利技术，提供了一种特异识别并直接结合纤连蛋白（ＦＮ）的ＥＤ－Ｂ癌胚结构域的特异结合成员。本发明专利技术还提供了制备该结合成员的材料与方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
本专利技术涉及纤连蛋白(FN)的胎儿期同工型ED-B的特异结合成员，通过免疫组织化学方法和对癌的体内靶向定位显示，ED-B在肿瘤形成的新生血管中也有表达。本专利技术还涉及与这些特异结合成员相关的材料和方法。大部分现有癌症治疗方法的主要目的是尽可能多地杀死癌的组成型细胞。化疗和放疗的局限性在于治疗缺乏特异性和对正常组织的毒副作用。提高肿瘤治疗特异性的一个方法是通过结合蛋白将药物携带到肿瘤，这种结合蛋白一般包含一个对在肿瘤细胞表面表达、正常细胞不表达的标记抗原有特异性的抗体的结合区。这种形式的靶向治疗，粗略定义为“魔弹”，其实例主要是来源于鼠类的对细胞表面表达的所谓“肿瘤相关”抗原有特异性的单克隆抗体。这些单抗或者以化学键与具细胞毒性的物质(例如，毒素或药物)连接，或者作为编码单抗和毒素的基因相连并串联表达的重组融合蛋白产生。“魔弹”技术虽然意义重大，在治疗人类癌症中有一定效果，尤其是对发生于淋巴的肿瘤的定向治疗效果显著，因为这种肿瘤的癌细胞易在循环系统中受到治疗药物的作用，但对“魔弹”的研究受到限制。然而治疗肿瘤块仍具有严重的临床困难，因为仅有小部分的细胞，主要是肿瘤的最外层细胞才暴露在循环系统中的治疗性免疫连接剂作用下。这些周边的靶细胞形成了对肿瘤内部所谓的“结合位点屏障”(Juweid等，1992,癌症研究，52 5144-5153)。肿瘤的组织结构因含有纤维基质和堆积甚紧的肿瘤细胞而很紧密，抗体大小的分子很难进入。而且，肿瘤因缺乏淋巴外排而有更高的细胞间压力，也阻碍了外来分子的流入。治疗药物进入肿瘤影响因素的最近综述，参看Jain,R(1994)，美国科学，27158-65。通过对“肿瘤相关”抗原的靶向定位来治疗肿瘤块有明显的局限性，但这些肿瘤确有一些共同特征，为抗体疗法提供了其他的抗原靶位。肿瘤增长超过一定大小后，它们就靠独立的供血系统来提供足够的氧和养料维持生长。如果能干扰或排除这些供血系统，就能饿死大量肿瘤细胞。肿瘤形成过程，血管生成表型发生转变，产生变化了的血管生成因子，作用于邻近的毛细血管的内皮细胞，诱发它们增殖和转移。与正常组织毛细血管的高度有序性形成鲜明对比，这些新形成的血管组织结构混乱，有盲端和导致渗漏增强的孔洞。血管生成的诱发过程伴有某些细胞表面抗原的过量表达，多数这样的表面抗原与正常组织血管相同。因此，鉴定出肿瘤新生血管的特殊抗原是通过对血管定向攻击进行固形肿瘤治疗的主要限制因素。本专利技术所涉及的抗原即针对这一问题。在肿瘤增生过程，其周围组织的胞外基质通过两个过程重新构建(1)正常组织胞外基质成分的蛋白质降解和(2)肿瘤诱发的细胞因子促进肿瘤细胞和基质细胞重新合成胞外基质成分。这两个过程在稳定情况下，产生一种“肿瘤胞外基质”，它提供更适合肿瘤增生的环境，并在质和量上有别于正常细胞。这种基质的成分中有肌腱蛋白和FN的大同工型。称这些蛋白为同工型因为它们存在转录、转录后和转译后水平的结构差异。本专利技术的主题是这种纤连蛋白的同工型即所谓的B+同工型(B-FN)。作为胞外基质和体液组成成分的纤连蛋白(FN)是多功能、高分子量的糖蛋白。它们参与多种生物过程，如正常细胞形态的形成和维持、细胞迁移、凝血和溶血、伤口愈合及肿瘤转化(综述见Alitalo等，1982；Yamada,1983；Hynes 1985；Ruoslahti等，1988；Hynes,1990；Owen等，1986)。FN的结构多样性是FN的初始转录产物的三个区域(ED-A、ED-B和Ⅲcs)经选择性剪接形成的(Hynes,1985；Zardi等，1987)，选择剪接产生了至少20种不同的同工型，其中一些在癌变和正常组织中表达不同。FN-pre-mRNA剪接方式有组织和发育特异性，在转化细胞及癌细胞中这种调节方式被破坏(Castellani等，1986；Borsi等，1987；Vartio等，1987；Zardi等，1989；Carnemolla等，1989；Oyama等，1989,1990；Borsi等，19926)。事实上，包含ED-A、ED-B及Ⅲcs序列的FN的同工型在转化及癌变细胞中比正常细胞表达增加，尤其是含ED-B序列的FN同工型(B+同工型)在胎儿及癌变组织和伤口愈合过程高度表达，而在正常成人组织中表达受到抑制(Norton等，1987；Schwarzbauer等，1987；Gurman和Kornblihtt 1987；Carnemolla等，1989；Ffench-Constant等，1989；Ffench-Constant和Hynes,1989；Laitinen等，1991)。B+FN分子在成熟血管中检测不到，但在正常的(如子宫内膜发育)、病理的(如糖尿病性视网膜病变)和癌变过程中的新生血管表达提高(Castellani等，1994)。ED-B序列是一个由单个外显子编码的包含91个氨基酸的完整的Ⅲ型重复。与由不同剪接方式形成的带有细胞类型特异性结合位点的ⅢCS同工型不同的是，A+和B+同工型生物功能尚在研究中(Humphries等，1986)。B+同工型本身即是一个肿瘤诱导的新抗原。另外，ED-B的表达暴露了在Ⅲ型重复7(位于ED-B之前)中原本隐蔽的一个抗原；由于这个位点在缺乏ED-B的FN中没有暴露，因此可认为ED-B的表达直接或间接地诱导了该抗原的表达。隐蔽抗原位点形成了单抗BC-1的靶位(Carnemolla等，1992)。BC-1的特异性及生物学功能在EPO 344 134131中有描述并且可以从保存在欧洲动物细胞保藏中心(PortonDown,Salisbury UK)的杂交瘤细胞(保藏号88042210)中得到。该单抗已成功地用于定位肿瘤的增生血管，而和成熟血管的内皮细胞没有交叉反应，显示FN同工型作为血管定位的抗体的潜力。但是，对BC-1的特异性应有清醒认识。BC-1不直接识别B+同工型，令人怀疑是否在某些组织中，BC-1识别的位点在没有ED-B存在下也会暴露，因而间接引起我们不希望的BC-1的交叉反应。此外，BC-1对人的B+FN有严格的特异性，意味着在动物中利用BC-1的分布进行肿瘤定位是不可能的。虽然已经生产出含有B+同工型的融合蛋白的多克隆抗体，但它们只与N-聚糖酶处理的，暴露出结合位点的FN反应。应用小鼠单抗更大问题是人的抗小鼠抗体(HAMA)反应(Schroff等，1985；Dejager等，1988)。HAMA反应有一定负作用，从中和药用抗体导致治疗剂量降低，到过敏反应，血清疾病和视网膜损伤。虽然已确证多抗血清与重组ED-B的反应性，但在免疫小鼠中分离与BC-1有相同特异性的单抗是很困难的，因为人和鼠的ED-B显示100％的序列同源性。因此鼠对这种貌似自身抗原的人的蛋白不会产生免疫反应。事实上，本领域经十多年研究，只鉴定出一种单抗能间接地与B+FN反应，而不直接识别ED-B(即BC-1)。BC-1的特异性是针对一个因ED-B而暴露的原本隐蔽的位点，而不是ED-B本身，这一点意义重大，因为小鼠FN中不存在ED-B，其免疫系统不会将ED-B作为“自己人”。实现本专利技术使用了不同于以前的技术，不必先用纤连蛋白或ED-B进行免疫。从丝状噬菌体表面展示的人类抗体的可变区文库中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异结合成员，它特异性识别纤连蛋白（ＦＮ）的ＥＤ－Ｂ癌胚结构域并与之直接结合。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D尼里，B加呢默拉，A斯里，E巴勒萨，P卡斯特拉尼，A皮尼，L萨迪，G温特，G尼里，L伯斯，
申请(专利权)人：菲罗根有限责任公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]
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