交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管柱辐照制备方法技术

一种交联聚丙烯酰胺类毛细管电泳涂层柱的辐照制备方法，属于毛细管电泳分析领域，是先用双功能团硅烷化试剂对毛细管内壁进行预处理，再经两次辐照来制备交联聚丙烯酰胺类毛细管电泳涂层柱，即在毛细管柱内充入丙烯酰胺类溶液进行辐照聚合，得到线性涂层柱；再经动态涂覆甲叉双丙烯酰胺等交联剂，辐照聚合得到交联涂层柱。制备方法简单、快速，反应条件温和，涂层内无催化剂（或引发剂）残余。柱重复性好，电渗流小，柱效高。所提供的方法可以用作柱的进一步改性。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于毛细管电泳分析领域，涉及辐照法制备交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱。毛细管电泳是八十年代初发展起来的一种新型分离技术，由于电泳是在细内径(25μm-100μm)的弹性石英毛细管中进行的，不使用柱填料，样品量和试剂消耗少、在线检测和操作简便而得到重视。近年来，这一技术在理论、仪器、应用等方面都取得了很大进展，用于离子、药物、糖、核酸、肽、蛋白质、病毒以及细胞等的分析；分离模式也逐渐多样化，除毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管凝胶电泳(CGE)和胶束电动色谱(MECC)外，还有亲和毛细管电泳(ACE)和毛细管电色谱(CEC)等。它很好地解决了大分子扩散系统小、传质阻力大的问题，成为同HPLC互补的一种分析技术；分离系统的多样性，使其可用于解决生命科学发展中的一些重要问题。虽然理论预测采用毛细管电泳分离蛋白质时可以达到上百万的理论塔板数，但实际上当用未处理柱时很难达到这样的目标，这主要是由毛细管的电渗和内壁对蛋白吸附所致，造成迁移时间的重复性与回收率变差。因此毛细管电泳的高效分离，有赖于对管壁的吸附和电渗这两个相关问题的解决，才能发挥出它应有的优势。大部分已报道的工作都是通过调节溶液pH、使用高盐浓度、添加剂或吸附中性和带电的大分子、制备化学键合相涂层来解决这两个问题。Hjerten(J.Chromatogr.,1984；347:191；USP4680 201,14 July 1987)采用有机硅烷化试剂键合至毛细管，然后制备非交联聚丙烯酰胺涂层并用于毛细管等电聚焦，Cobb等(Anal Chem,1990；62:2478)采用格氏试剂制备Si-C亚层，然后再同丙烯酰胺共聚，前者线性涂层稳定性差，而后者制备要求高，其他柱制备方法(Huang M,et al.Electrophoresis,1995；16:396；Nasabeh W,etal.J.Chromatogr.,1991；559:367)也都存在柱制备时间长、操作繁琐等问题。本专利技术的目的在于提供一种交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱的辐照制备方法，利用该法制备的柱可对蛋白质、核酸、糖、肽等进行高效分离，能够减小样品同毛细管的作用和毛细管电渗。本专利技术考虑到已有的各种涂层的性能和稳定性，并结合辐照技术，两次辐照制备交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱。硅烷偶联剂的结构为SiX3(CH2)nY。偶联剂分子一端的X基团可以是烷氧基(如三甲氧基、三乙氧基)或氯，易水解成有缩聚能力的硅羟基，它与无机物表面的羟基发生缩聚反应，形成-Si-O-Si-键或氢键另一端的官能团Y可以是乙烯基、丙烯基、丙烯酰氧基、异丁烯酰基、甲基、氨丙基等，能与有机化合物中的官能团发生反应，生成共价键。用于制备丙烯酰胺类线性聚合物的单体为丙烯酰胺及其取代的衍生物单体，所用交联剂为多官能团单体，如甲叉双丙烯酰胺类。本专利技术交联聚丙烯酰胺类毛细管电泳涂层柱的辐照聚合制备方法是按下述步骤1．取一定内径的石英或玻璃毛细管，先进行柱清洗，包括用去离子水、碱(NaOH或KOH)、甲醇进行洗涤；2．毛细管内壁预涂硅烷类偶联剂。毛细管内充入硅烷类偶联剂溶液，如水、丙酮、二氯甲烷、甲苯，常温进行反应，时间30min～2h，然后分别用去离子水和甲醇冲洗，用惰性气体吹干；3．毛细管内充入已脱气的丙烯酰胺类溶液后，辐照10min～1h，剂量率为500～3000Gy/h，然后用去离子水洗去吸附的聚合物；4．毛细管柱内通以不同浓度的交联剂，保持几分钟后，以惰性气体吹干，辐照10min～1h，剂量率为1000～6000Gy/h。通过本专利技术制备交联聚丙烯酰胺类毛细管柱，所需时间短、操作简单、易于重复、无催化剂(或引发剂)残留、柱效较高。下面结合附图进一步说明制备方法的实施过程及交联聚丙烯酰胺类毛细管柱的应用。其中附图说明图1为交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱分离标准蛋白，谱峰1．细胞色素C；2．溶菌酶；3．马肌红蛋白；4．胰凝乳蛋白酶原A。图2A为对卵清蛋白的分离谱图。图2B为胰蛋白酶抑制剂的分离谱图。图3为毛细管电泳分离寡核苷酸。实例1交联聚丙烯触类毛细管电泳涂层柱的辐照聚合制备石英毛细管先经去离子水洗5min，充入1mol/L NaOH后放置30min，再用去离子水洗10min。在毛细管内充入3％γ-甲基丙烯基氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)/冰醋酸∶水(1∶1)，室温反应1h后，用去离子水洗5min，高纯氮吹5min。制备线性涂层时，毛细管内充入已脱气的3％丙烯酰胺溶液，在2500Gy/h强度下辐照30min，再用水洗去吸附的聚丙烯酰胺。第二次辐照时，毛细管柱内通以不同浓度的甲叉双丙烯酰胺并保持5min，用高纯氮吹干后，进行辐照交联，强度为2500Gy/h，辐照15min。实例2交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱分离几种标准蛋白按上述实例1制备的交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱对几种标准蛋白(见表1)进行了分离。图1所示为标准蛋白的电泳谱图。电泳条件为40mmol/LTris-H3PO4缓冲液，pH4.0,16kV×37μA，压力进样2秒。表1标准蛋白的等电点及分子量 实例3涂层柱的电渗测定制备不同pH 50mmol/L磷酸缓冲液(加入1mol/L NaOH调节pH)，来评价未涂层和涂层柱电渗随pH变化。当溶液pH从3升至8时，涂层柱的电渗流值由0.036×10-8m2/v.s升高到0.6×10-8m2/v.s，有效地抑制了电渗。电泳条件未处理柱，37cm×50μm(I.D.),20kV；涂层柱，27cm×50μmI.D,16kV，中性标记物为1％二甲基甲酰胺。实例4卵清蛋白和胰蛋白酶抑制剂的分离按上述实例1制备的交联聚丙烯酰胺涂层毛细管电泳柱对卵清蛋白(如图2A所示)、胰蛋白酶抑制剂进行了分离(如图2B所示)，电泳条件50mmol/LTris-glycine pH8.4 37cm×50μm(I.D.)，工作电压16kV，反极性。实例5毛细管电泳分离寡核苷酸毛细管电泳已被用于寡核苷酸、DNA合成产物和酶切片段的分离，按上述实例1制备的电泳柱用于无胶筛分电泳分离pBR322/HinfIMK片段，结果如图3所示。电泳条件89mmol/LTris-硼酸，羟丙基甲基纤维素浓度0.8％,2mmol/LEDTA缓冲液pH8.3；27cm×50μm(I.D.)，工作电压8kV，反极性。权利要求1．一种交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱的辐照制备方法，是将交联聚丙烯酰胺类涂层通过硅烷偶联剂结合于毛细管管壁。采用石英或玻璃毛细管，经去离子水、碱(NaOH或KOH)、甲醇先进行清洗后，毛细管内充入硅烷类偶联剂溶液，常温进行反应，时间不少于30分钟，然后分别用去离子水和甲醇冲洗，吹干，即为具有硅烷类偶联剂预涂层的毛细管柱。其中硅烷偶联剂的结构为SiX3(CH2)nY，偶联剂分子一端的X基团可以是烷氧基(如三甲氧基、三乙氧基)或氯，易水解成有缩聚能力的硅羟基，它与无机物表面的羟基发生缩聚反应，形成-Si-O-Si-键或氢键；另一端的官能团Y可以是乙烯基、丙烯基、丙烯酰氧基、异丁烯酰基、甲基、氨丙基等，能与有机化合物中的官能团发生反应，生成共价键。交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱的辐照制备方法其特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱的辐照制备方法，是将交联聚丙烯酰胺类涂层通过硅烷偶联剂结合于毛细管管壁。采用石英或玻璃毛细管，经去离子水、碱（ＮａＯＨ或ＫＯＨ）、甲醇先进行清洗后，毛细管内充入硅烷类偶联剂溶液，常温进行反应，时间不少于３０分钟，然后分别用去离子水和甲醇冲洗，吹干，即为具有硅烷类偶联剂预涂层的毛细管柱。其中硅烷偶联剂的结构为Ｓ↓［１］Ｘ↓［３］（ＣＨ↓［２］）↓［ｎ］Ｙ，偶联剂分子一端的Ｘ基团可以是烷氧基（如三甲氧基、三乙氧基）或氯，易水解成有缩聚能力的硅羟基，它与无机物表面的羟基发生缩聚反应，形成－Ｓ↓［ｉ］－Ｏ－Ｓ↓［ｉ］－键或氢键；另一端的官能团Ｙ可以是乙烯基、丙烯基、丙烯酰氧基、异丁烯酰基、甲基、氨丙基等，能与有机化合物中的官能团发生反应，生成共价键。交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳 柱的辐照制备方法其特征在于，采用两次辐照的方法制备交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱。首先在预涂硅烷类偶联剂层毛细管内充入已脱气的丙烯酰胺类溶液，用于制备线性聚合物的单体为丙烯酰胺及其取代的衍生物，辐照引发丙烯酰胺类单体与硅烷偶联剂的聚合反应，辐照时间１０ｍｉｎ～１ｈ，剂量率为５００～３０００Ｇｙ／ｈ，用去离子水洗去吸附的聚合物，此为线性聚丙烯酰胺类涂层毛细管柱。然后在线性聚丙烯酰胺类涂层毛细管柱内充以多官能团单体，可以是甲叉双丙烯酰胺类交联剂，保持几分钟后，以惰性气体吹干，辐照时间为１０ｍｉｎ～１ｈ，剂量率为１０００～６０００Ｇｙ／ｈ此为交联聚丙烯酰胺类涂层毛细管电泳柱。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓达，王全立，马立人，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]