纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备技术

本发明专利技术提供了一种通过等电聚焦从溶液或悬浮液中以工业化的规模分离和纯化带电物质的设备和方法。该设备包括分离室，一对放置在分离室中的端部的垂直电极（９），位于每一个电极（９）附近用于将电极空间和设备中央部分分开的阴离子或阳离子选择膜（１０），位于室上部的用于分离液体组分的一个或多个流出口（１２），位于每个电极空间上部的辅助流出口（１１），至少在所述流出口（１１，１２）高度上在每一个所述的流出口之间的、隔开所述室的一个或多个垂直壁（６），多个保证无对流地向上流动的可渗透的垂直间壁（１３）。本发明专利技术设备不需额外的两性缓冲溶液以建立合适的ｐＨ梯度，能用于纯化多核苷酸、氨基酸、肽、蛋白质、有机溶剂和饮料。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过连续流动等电聚焦(isoelectric focusing)的新方法(连续聚焦)和设备(连续聚焦器，contifocuser)纯化、离析、浓缩和分离有机或生物物质，一种利用低电导场(electrically low-conductivefield)浓缩或分离带电物质的技术。不必使用离心、过滤、吸附或载体电解质或两性电解质缓冲液以建立合适的pH梯度。用等电聚焦分离带电分子，如从含蛋白质的混合物中分离蛋白质，是已知技术，其原理是带电两性分子在特定pH，即所谓的等电点(pI值)下净电荷为零。如果经受一电场，物质将迁移到自身等电点的pH，因此得到分离。静电等电聚焦方法和设备是已知的，例如公开在WO79/00942、EP-A-256552和US 5,256,269中。这种类型设备的缺点是纯化量少，其收集是以批式操作进行的。本专利技术技术背景描述在US 4,465,582(1982)中的连续流动电泳设备中，在电极室中应用了控制的流体流动，流动是平行的，但独立于“工作”室中的流动。US 5,160,594公开了一种等电聚焦设备，在每一个槽中具有强制循环，即循环等电聚焦过程。在本专利技术中不使用循环。美国专利使用一串装置以防止部分纯化的和未纯化的两性物质之间的混合。在每个槽中需要附加冷却来降低电阻的发热。通过离子选择膜，将强酸和强碱，即阴极电解液和阳极电解液限制在电极室中，以抗御带负电或正电的离子，并建立合适的pH梯度。与US 5,160,594不同，本专利技术使用离子选择膜用于不同的目的，即选择允许低分子物质通过电极空间，并从电极流出口排出。所有现有技术中的装置都需要载体两性电解质用于工作室，它们具有相对低的电导率和缓冲能力。US 5,160594公开的最大电导率高达600μS/cm，比本专利技术的高达5000μS/cm的电导率低得多。与其它现有技术的装置一样，不是设计用来在工业规模上进行纯化的，此外，US 5,160,594没有提供纯化物质的实施例。不使用载体两性电解质缓冲溶液，但用于工业规模的连续流动等电聚焦方法和设备公开在匈牙利专利210,584(1992)中。该专利描述了一种通过迁移(gravitation)到分离室达到流出口高度的上流系统。该系统具有两个非导电溶液室，其中第二室具有两个或多个溶液流出口，以及一个溶液从第一室流入第二室底部的下流通道。一对电极位于第二室。在第二室中设置多个相邻的间壁，间壁延伸穿过该室，以在水平方向上基本上没有溶液的对流和逆流通道。HU 210,584的缺点是在流入溶液室中，可能自身形成梯度。溶液的流入是通过滴加进行的，难以控制。与本专利技术类似，匈牙利专利中的上流系统的固有梯度形成不易受损，但是，两室系统复杂，难于构造。此外，有机溶液的分离发生在第二分离室的相对两侧，靠近电极。无机离子容易与要分离的单组分无机或生物物质混合。通过需要第二分离步骤。专利技术描述本专利技术提供一种在导电溶液中分离物质的连续聚焦器，该设备是由非导电材料制成，包括一个砖块状的分离室，其具有一个液体流入口，两个电极空间流出口，一个或多个工作溶液流出口，以及溶液从底部向上流动到顶部流出口的通道。分离室的高度、宽度和深度的比可以如3∶2∶0.2。沿分离室的两个最窄的相对壁的竖向位置上设置一对电极。它们用于连接外部直流(DC)电源。设备被两个由离子选择膜制成的间壁分为三部分。这些间壁在设备中靠近电极的两侧垂直定位，以至于它们中的每一个都离开两端约1/25-1/15。两间壁在底部都有开孔，其直径为设备流入管的一半。特别地，包围阴极空间的是阳离子选择膜，而另一个是阴离子选择膜。离子选择膜具有选择允许阳离子或阴离子通过的专一性以从废物流出口清除。在两端，废物流出孔位于电极附近，与顶边的距离为设备的1/40-1/10。工作流出口用于收集要纯化和物质，位于相同的高度，在中间。有利的是连续聚焦器具有至少三个所述流出口。除电极空间外，在流出口之间是由非导电材料制成的分割间壁，其上部四分之一闭合，从底部向上，如至其高度的四分之三处具有小的开孔。作为进一步的改进，可以在设备的上述间壁之间的剩余空间内放置多个相邻交替的锯齿形或T形或多T形间壁元件，但电极空间除外。这些也由非导电材料制成，被穿孔或由离子或分子可双向渗透的多孔材料制成，从底部向上延伸至工作流出口最低高度，并延伸跨过室。间壁自由地放置在设备的整个宽度上，是一种新元件，使溶液基本上没有对流，但是，使电解质或两性颗粒在水平方向上未扰动的流动。穿孔膜成相互间隔关系，以至于提供了未扰动的垂直流动。本专利技术与现有技术的设备相比具有一重要的优点，它可以处理高达3,600L/天的蚯蚓酶(按现有技术HU 210,584280-300L)，生产80,000-170,000U纯化酶/L/天(HU 210,58460,000-70,000U)。本专利技术的另一优点是溶液或悬浮液可以具有50-5000μS/cm的电导率，而不是现有技术的装置中的50-2000μS/cm(US5,160,594在表中描述的电导率高达600μS/cm)。在本专利技术中，溶液沿所述设备中的化学惰性通道流动，垂直向上通过多个由两膜间壁之间的垂直的流路，膜间壁将分开的电极和其间的工作空间分开。少量的溶液水平流动通过这些间壁上的小孔。在电极之间施加一偏压(bias voltage)，使得带电组分在水平方向上分离，并在水平方向上向跨过设备向阴极或阳极移动。当组分通过位于设备上部附近的流出口流出时，被收集。小的低分子量和带电组分，即金属和离子，向电极空间移动。它们经废物流出口从设备中排出，这样，它们与向设备中央移动的较高分子量物质分离。在本专利技术中，目标物质至少包括一种以其pI值为特征的两性物质，所述物质被两性杂质所包围。当施加偏压电势时，由所述杂质在设备水平方向上形成pH梯度。在pH梯度上，两性物质被驱动到其pH值与所述物质pI相当的点上，并被中和(neutralised)。因此，物质向设备上部的流出口垂直流动。为了提高设备的能力，两个连续聚焦器以成对构造的方式靠在一起，由防水壁隔开。这种“成对聚焦器”具有共用的电极空间(2，4)，位于设备的两端，一对电极供两个聚焦室使用。成对聚焦器具有共用的流入口(7)，位于设备的底部中央，入流在两个聚焦器之间等份分配。从两个电极空间可以设置一个或两个电极流出口(11)。成对聚焦器在两侧都有工作流出口(12)，这一点正如最初的连续聚焦器。成对聚焦器的流量增加了一倍，分离能力也增加了一倍，但所需的电能只增加三分之一。下面描述在工业规模上纯化、分离和浓缩生物物质。不需离心、过滤、吸附步骤或额外载体两性电解质缓冲以建立合适的pH梯度。在设备的整个宽度上垂直设置多个细分和穿孔的、颗粒可以双向穿过的间壁，这是一种新方式，使溶液基本上没有对流，产生了没有扰动的垂直流体流动。连续聚焦器被设计用来成本有效地纯化如质粒、肽、氨基酸、酶、免疫球蛋白、抗原，用于诊断试剂盒，或者制备病毒或细菌亚单位疫苗、变应素，以及用于分离细胞集合体或在乳汁、血液、或尿中所含的重组体产品。连续聚焦器还可以用于从酵母或细菌发酵过程、抗生素、有机溶剂、饮用水和饮料中除去杂质或有毒物质。连续聚焦器也可以用于分离或纯化从微生物(包括细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过等电聚焦分离液体介质中的带电物质的连续流动设备，包括：分离室，一对放置在分离室中的其横截端部的垂直电极，位于室上部同一高度的两个或多个流出口，所述两个或多个流出口的每一个之间的至少在所述流出口高度上分割所述室的垂直壁，至少一个可渗透垂直间壁，其特征在于：该设备进一步包括用于将电极空间与所述液体室中央部分分开的、位于阴极附近的垂直阳离子选择膜和位于阳极附近的垂直阴离子选择膜，在每个电极空间内的位于所述室上部的辅助流出口。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：赫尔本福佩德伯尔，奥托索瓦，
申请(专利权)人：塞尔伯吕企业公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]