用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法技术

提供用于提供单‑聚乙二醇化组合物的方法。该方法特别适合于提供单‑聚乙二醇化红细胞生成素组合物。该方法包含使包含非‑聚乙二醇化、单‑聚乙二醇化和寡‑聚乙二醇化的混合物经历疏水作用色谱法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法专利
本专利技术涉及用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，特别是用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。特别地，本专利技术涉及用于提供单-聚乙二醇化红细胞生成素(EPO)组合物的方法。背景蛋白质的聚乙二醇化是指一个或多个PEG(聚乙二醇)基团添加至蛋白质。聚乙二醇化特别地用于治疗蛋白，例如，这归因于它增加体内循环半衰期。然而，聚乙二醇化还可以降低治疗蛋白的生物活性，由此降低其有效性。因此。在增加的循环时间与降低的治疗功效之间的平衡被打断。对于某些治疗蛋白，单-聚乙二醇化为特别期望的，因为它提供了改善的稳定性，而不会显著地损害治疗功效。单-聚乙二醇化治疗蛋白包括和为红细胞生成素(EPO)的单-聚乙二醇化形式且用于治疗贫血。聚乙二醇化反应倾向于产生包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物。有利于高程度聚乙二醇化(例如长反应时间、高PEG/蛋白质摩尔比)的反应条件倾向于产生具有高比例的寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物，这在单-聚乙二醇化蛋白质为期望的产物时产生低收率。有利于低程度聚乙二醇化(例如短反应时间、低PEG/蛋白质摩尔比)的反应条件倾向于产生具有高比例的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的混合物，这在单-聚乙二醇化蛋白质为期望的产物时也产生低收率。治疗蛋白对于制备而言通常是昂贵的，因此，提供良好收率的单-聚乙二醇化治疗蛋白(作为未反应的和/或寡-聚乙二醇化的治疗蛋白消耗最少)的方法在商业上是有利的且由此为特别期望的。已经尝试研发使关注蛋白质聚乙二醇化的方法、同时结合离子交换色谱柱，以便操控聚乙二醇化的特异性，且由此改善具有期望的聚乙二醇化程度的蛋白质的收率(所谓的“柱上”法)。这类方法在技术上是复杂的且耗时，因此具有低产率。这类方法还可能消耗相对大量的聚乙二醇化试剂，使得它们在商业上处于不利状态。不同的“柱上”聚乙二醇化方法在Pfister(ReacReact.Chem.Eng.，2016，1,204)、Ingold(2016)和Fee&VanAlstine(2006)中讨论。提供单-聚乙二醇化蛋白质的方法可以包含进行聚乙二醇化反应，得到包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物，且然后进行纯化步骤以纯化单-聚乙二醇化蛋白质。WO2009/010270和WO2012/035037涉及用于从包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物纯化单-聚乙二醇化EPO的方法。该纯化方法牵涉使得自聚乙二醇化反应的混合物经历至少一种阳离子交换色谱法(CEC)步骤。CEC步骤以结合和洗脱模式进行，并且不同的洗脱级分包含大部分非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化或寡-聚乙二醇化EPO。这类CEC方法必须在低于蛋白质的等电点下进行，就EPO而言(等电点为4.0-5.5)，牵涉在pH约3.0下的CEC。用于生产单-聚乙二醇化蛋白质的方法通过进行聚乙二醇化反应且然后从得到的混合物中纯化单-聚乙二醇化蛋白质进行，该方法牵涉再循环未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质。这些方法牵涉回收未反应的蛋白质并且将其添加至随后的聚乙二醇化反应中。这类再循环改善了单-聚乙二醇化蛋白质的总收率。Pfister(Biotech和Bioeng，2016)描述了一种方法，其中进行聚乙二醇化反应，然后从包含未反应的(非-聚乙二醇化)、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物中纯化单-聚乙二醇化蛋白质。在该方法中，回收未反应的蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应。该纯化方法包含结合和洗脱模式的阳离子交换色谱法(CEC)，其中以依次洗脱方式分离未反应的蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质。最后，使用高盐洗脱缓冲液洗脱未反应的蛋白质。在CEC的最后阶段洗脱未反应的蛋白质会延迟未反应蛋白质的再循环，因为在再循环之前会通过渗滤对其进行处理，从而降低了该方法的总产率。根据上述考量设计了本专利技术。专利技术概述本专利技术涉及用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。本专利技术的方法特别适合于提供单-聚乙二醇化EPO组合物。本文所述的方法的优点包括高收率和产率以及单-聚乙二醇化产物的高纯度。本专利技术涉及一种方法，其中使包含非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质混合物经历两阶段疏水作用色谱(HIC)步骤。两阶段HIC步骤牵涉在特定条件(“两阶段HIC条件”)下将蛋白质混合物施加于两种HIC材料：第一种HIC材料在那些条件下仅结合寡-聚乙二醇化蛋白质；且第二种HIC材料在那些相同条件下结合单-聚乙二醇化蛋白质。即第一种HIC材料在两阶段HIC条件下结合寡-聚乙二醇化蛋白质、但不结合非-聚乙二醇化蛋白质或单-聚乙二醇化蛋白质。第二种HIC材料在两阶段HIC条件下结合单-聚乙二醇化蛋白质，并且能够在两阶段HIC条件下结合寡-聚乙二醇化蛋白质，但在本文公开的方法中，基本上所有的寡-聚乙二醇化蛋白质均已经被第一种HIC材料而除去，由此在实施本专利技术的过程中，第二种HIC材料不一定结合寡-聚乙二醇化蛋白质，或不结合大量的寡-聚乙二醇化蛋白质。特别地，本专利技术提供用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化组合物的方法，该方法包含：a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质混合物；b)使该蛋白质混合物经历两阶段疏水作用色谱(HIC)步骤，其包含：将蛋白质混合物施加于第一种HIC材料，得到第一HIC流通溶液；和将第一HIC流通溶液施加于第二种HIC材料，得到第二HIC流通溶液，其中第二种HIC材料与第一种HIC材料不同；并且其中两阶段HIC步骤在两阶段HIC条件下进行，该两阶段HIC条件适合于使寡-聚乙二醇化蛋白质结合至第一种HIC材料，并且使单-聚乙二醇化蛋白质结合至第二种HIC材料；和c)从第二种HIC材料上洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到第二HIC洗脱液，其中第二HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。“第二HIC洗脱液”也可以称作“第二种HIC材料洗脱液”，因为其为来自两阶段HIC步骤中的第二种HIC材料的洗脱液。在本文公开的方法中，单-聚乙二醇化蛋白质组合物可以包含相当高比例的单-聚乙二醇化蛋白质。例如，该蛋白质组合物可以包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。蛋白质可以为红细胞生成素(EPO)。蛋白质可以为激素。蛋白质可以为激素、细胞因子、酶或抗体。单-聚乙二醇化蛋白质可能是期望的，因为它们在增加的半衰期与相对于蛋白质的非聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化形式的相差无几生物学活性之间取得平衡。然而，聚乙二醇化反应倾向于产生包含非聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化的蛋白质和寡-聚乙二醇化的蛋白质的混合物。蛋白质、特别是治疗性蛋白质对于制造而言通常是昂贵的，且由此特别需要提供高收率的单-聚乙二醇化治疗蛋白的方法。提供良本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化组合物的方法，该方法包含：/na)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质混合物；/nb)使所述蛋白质混合物经历两阶段疏水作用色谱(HIC)步骤，其包含：/n将所述蛋白质混合物施加于第一种HIC材料，得到第一HIC流通溶液；和/n将第一HIC流通溶液施加于第二种HIC材料，得到第二HIC流通溶液，/n其中第二种HIC材料与第一种HIC材料不同；且/n其中两阶段HIC步骤在两阶段HIC条件下进行，该两阶段HIC条件适合于使寡-聚乙二醇化蛋白质结合至第一种HIC材料并且使单-聚乙二醇化蛋白质结合至第二种HIC材料；并且/nc)从第二种HIC材料上洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到第二HIC洗脱液，其中第二HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171229 EP 17211103.11.用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化组合物的方法，该方法包含：
a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质混合物；
b)使所述蛋白质混合物经历两阶段疏水作用色谱(HIC)步骤，其包含：
将所述蛋白质混合物施加于第一种HIC材料，得到第一HIC流通溶液；和
将第一HIC流通溶液施加于第二种HIC材料，得到第二HIC流通溶液，
其中第二种HIC材料与第一种HIC材料不同；且
其中两阶段HIC步骤在两阶段HIC条件下进行，该两阶段HIC条件适合于使寡-聚乙二醇化蛋白质结合至第一种HIC材料并且使单-聚乙二醇化蛋白质结合至第二种HIC材料；并且
c)从第二种HIC材料上洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到第二HIC洗脱液，其中第二HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。


2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。


3.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。


4.根据上述权利要求任一项的方法，其中第一种HIC材料和第二种HIC材料直接以串联连接。


5.根据上述权利要求任一项的方法，其中在两阶段HIC条件下，第一种HIC材料不结合非-聚乙二醇化蛋白质或单-聚乙二醇化蛋白质，并且其中第二种HIC材料不结合非-聚乙二醇化蛋白质。


6.根据上述权利要求任一项的方法，其中在对比HIC洗脱色谱图中，第一种HIC材料和第二种HIC材料具有单-聚乙二醇化蛋白质的良好分离的峰。


7.根据上述权利要求任一项的方法，其中
a)第一种HIC材料在两阶段HIC条件下具有与PhenylSepharoseHP基本上相同的选择性；且
b)第二种HIC材料在两阶段HIC条件下具有与ToyopearlPhenyl650M基本上相同的选择性。


8.根据上述权利要求任一项的方法，其中
a)第一种HIC材料为PhenylSepharoseHP；和/或<...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·克恩莱因，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH