用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法技术

提供了用于提供包含单‑聚乙二醇化蛋白质和寡‑聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，并且提供了用于提供具有高收率和产率的单‑聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。所述的方法特别适合于提供单‑聚乙二醇化红细胞生成素组合物。这些方法包含使非‑聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非‑聚乙二醇化、单‑聚乙二醇化和寡‑聚乙二醇化蛋白质的混合物，使该混合物经历阴离子交换色谱步骤，并且将非‑聚乙二醇化蛋白质再循环入进一步的聚乙二醇化反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法专利
本专利技术涉及用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，特别是用于提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，并且提供用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。特别地，本专利技术涉及用于提供包含单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO的聚乙二醇化红细胞生成素(EPO)组合物的方法和用于提供单-聚乙二醇化红细胞生成素(EPO)组合物的方法。背景蛋白质的PEG化或聚乙二醇化是指一个或多个PEG(聚乙二醇)基团添加至蛋白质。聚乙二醇化特别地用于治疗蛋白，例如，这归因于它增加体内循环半衰期。然而，聚乙二醇化还可以降低治疗蛋白的生物活性，由此降低其有效性。因此。在增加的循环时间与降低的治疗功效之间的平衡被打断。对于某些治疗蛋白，单-聚乙二醇化为特别期望的，因为它提供了改善的稳定性，而不会显著地损害治疗功效。单-聚乙二醇化治疗蛋白包括和为红细胞生成素(EPO)的单-聚乙二醇化形式且用于治疗贫血。聚乙二醇化反应倾向于产生包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物。有利于高程度聚乙二醇化(例如长反应时间、高PEG/蛋白质摩尔比)的反应条件倾向于产生具有高比例的寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物，这在单-聚乙二醇化蛋白质为期望的产物时产生低收率。有利于低程度聚乙二醇化(例如短反应时间、低PEG/蛋白质摩尔比)的反应条件倾向于产生具有高比例的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的混合物，这在单-聚乙二醇化蛋白质为期望的产物时也产生低收率。治疗蛋白对于制备而言通常是昂贵的，因此，提供良好收率的单-聚乙二醇化治疗蛋白(作为未反应的和/或寡-聚乙二醇化的治疗蛋白的最少浪费)的方法在商业上是有利的且由此为特别期望的。已经尝试研发使关注蛋白质聚乙二醇化方法、同时结合离子交换色谱柱，以便操控聚乙二醇化的特异性，且由此改善具有期望的聚乙二醇化程度的蛋白质的收率(所谓的“柱上”法)。这类方法在技术上是复杂的且耗时，因此具有低产率。这类方法还可能消耗相对大量的聚乙二醇化试剂，使得它们在商业上处于不利状态。不同的“柱上”聚乙二醇化方法在Pfister(ReacReact.Chem.Eng.，2016，1，204)、Ingold(2016)和Fee&VanAlstine(2006)中讨论。提供单-聚乙二醇化蛋白质的方法可以包含进行聚乙二醇化反应，得到包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物，且然后进行纯化步骤以纯化单-聚乙二醇化蛋白质。WO2009/010270和WO2012/035037涉及用于从包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物纯化单-聚乙二醇化EPO的方法。该纯化方法牵涉使得自聚乙二醇化反应的混合物经历至少一种阳离子交换色谱法(CEC)步骤。进行CEC步骤以结合和洗脱模式，并且不同的洗脱级分包含大部分非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化或寡-聚乙二醇化EPO。这类CEC方法必须在低于蛋白质的等电点下进行，就EPO而言(等电点为4.0-5.5)，牵涉在pH约3.0下的CEC。用于生产单-聚乙二醇化蛋白质的方法通过进行聚乙二醇化反应且然后从得到的混合物中纯化单-聚乙二醇化蛋白质进行，该方法牵涉再循环未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质。这些方法牵涉回收未反应的蛋白质并且将其添加至随后的聚乙二醇化反应中。这类再循环改善了单-聚乙二醇化蛋白质的总收率。Pfister(Biotech和Bioeng，2016)描述了一种方法，其中进行聚乙二醇化反应，然后从包含未反应的(非-聚乙二醇化)、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物中纯化单-聚乙二醇化蛋白质。在该方法中，回收未反应的蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应。该纯化方法包含结合和洗脱模式的阳离子交换色谱法(CEC)，其中以依次洗脱方式分离未反应的蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质。最后使用高盐洗脱缓冲液洗脱未反应的蛋白质。因此，再循环未反应的蛋白质需要通过渗滤除去盐，然后进行进一步聚乙二醇化反应。对于除去盐的需求降低了产率并且增加了方法的复杂性。根据上述考量设计了本专利技术。专利技术概述本专利技术涉及用于提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法和用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。本专利技术的方法特别适合于提供包含单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO的聚乙二醇化EPO组合物以及单-聚乙二醇化EPO组合物。本文所述的方法的优点包括高收率和产率。在第一个方面，本专利技术提供用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：(a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；(b)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物的比例增加；IEC步骤包含使反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；和(c)从步骤b)中收集IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。可以通过洗脱在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且用于随后的聚乙二醇化反应。即步骤b)还可以包含洗脱IEC洗脱液中的非-聚乙二醇化蛋白质。IEC洗脱液包含非-聚乙二醇化蛋白质。该方法可以牵涉步骤(a)、(b)和(c)的两个或多个循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。IEC步骤可以为阴离子交换色谱(AEC)步骤或阳离子交换色谱(CEC)步骤。本专利技术提供用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：(a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；(b)使反应产物的混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物的比例增加；AEC步骤包含使反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于AEC材料；和(c)从步骤b)中收集AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，其中通过从AEC材料中洗脱AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。该方法可以牵涉步骤(a)、(b)和(c)的两个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：/na)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；/nb)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；/nIEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；和/nc)从步骤b)中收集IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，/n其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171229 EP 17211124.71.用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：
a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；
b)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；
IEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；和
c)从步骤b)中收集IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，
其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。


2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。


3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。


4.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC步骤为阴离子交换(AEC)步骤。


5.根据上述权利要求任一项的方法，其中进行步骤a)、b)和c)的两个或多个循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。


6.根据权利要求5的方法，其中该方法包含3、4或5个循环，其中在每个循环的步骤b)中，回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应。


7.根据权利要求5或权利要求6的方法，其中步骤c)还包含汇集从每个IEC步骤中收集的流通溶液，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。


8.根据上述权利要求任一项的方法，其中从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。


9.根据上述权利要求任一项的方法，其中将步骤b)IEC的洗脱液直接添加到随后的聚乙二醇化反应中。


10.根据上述权利要求任一项的方法，其中回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应，并且，其中还将新鲜的非-聚乙二醇化蛋白质加入到随后的聚乙二醇化反应中，以便在每次聚乙二醇化反应维持基本上恒定的聚乙二醇化反应条件。


11.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。


12.根据上述权利要求任一项的方法，其中：
i.反应产物的混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或
ii.IEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·克恩莱因，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH