对生物材料评估腺病毒或腺相关病毒的病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒制造技术

用于评估生物材料中具有指示特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法和流体样品，所述表位指示腺相关病毒的病毒类型或腺病毒的病毒类型，所述方法使用与表位特异性结合的荧光抗体染色剂，其中对具有病毒尺寸颗粒和荧光抗体染色剂的流体样品进行流式细胞术，以鉴定荧光发射检测事件，该事件指示有非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过流式细胞仪的流动池，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含所述病毒尺寸颗粒和荧光抗体染色剂。

【技术实现步骤摘要】
对生物材料评估腺病毒或腺相关病毒的病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒本申请是中国专利技术申请(专利技术名称：对生物材料评估腺病毒或腺相关病毒的病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒，申请日：2016年3月23日；申请号：201680029169.7；国际申请号：PCT/US2016/023742)的分案申请。交叉引用本申请要求以下美国临时专利申请的优先权且将它们每一个引入作为参考：序列号62/280,079，名称为FLOWCYTOMETRYMETHODFOREVALUATINGBIOLOGICALMATERIALFORUNASSOCIATEDPARTICLESOFVIRUSSIZE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00035；序列号62/280,029，名称为EVALUATINGBIOLOGICALMATERIALFORUNASSOCIATEDVIRUS-SIZEPARTICLESOFBACULOVIRUSVIRALTYPE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00036；序列号62/280,042，名称为EVALUATINGBIOLOGICALMATERIALFORUNASSOCIATEDVIRUS-SIZEPARTICLESOFADENOVIRUSVIRALTYPE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00037；序列号62/280,048，名称为EVALUATINGBIOLOGICALMATERIALFORUNASSOCIATEDVIRUS-SIZEPARTICLESOFADENO-ASSOCIATEDVIRUSVIRALTYPE，2016年1月18日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00041；序列号62/273,874，名称为FLOWCYTOMETRYMETHODFOREVALUATINGBIOLOGICALMATERIALFORUNASSOCIATEDPARTICLESOFVIRUSSIZE，2015年12月31日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00040；和序列号62/137,102，名称为FLOWCYTOMETRYMETHODFOREVALUATINGBIOLOGICALMATERIALFORUNASSOCIATEDPARTICLESOFVIRUSSIZE，2015年3月23日提交，且其代理机构案卷编号为50911-00027。
本专利技术涉及用于评估生物材料的病毒类型的非缔合的病毒尺寸颗粒的流式细胞术，所述病毒类型为腺病毒或腺相关病毒(AAV)。
技术介绍
腺病毒和腺相关病毒是无包膜病毒，其通过流式细胞术特别难以准确定量。所谓量化或定量是指计数和确定各病毒颗粒的浓度。腺病毒是尺寸大约90至100纳米的非包膜病毒家族，其具有含有尺寸为26至48kbp的双链DNA基因组的的二十面体核衣壳。腺病毒对许多脊椎动物宿主有感染性，包括感染人的许多不同的血清型。腺病毒是用于许多病毒治疗应用的重要病毒，包括用于溶瘤、基因治疗和免疫治疗应用。腺病毒是将遗传负载物递送到特定细胞类型(特别是肿瘤细胞)的主要手段之一。腺病毒具有很高的潜在毒性，对腺病毒进行严格且准确的监测和定量在各个制造阶段以及对于在病毒治疗制剂中的精确给药都是非常重要的。例如，已知腺病毒在人类中，主要在儿童中，引起呼吸系统疾病，并且关键的病毒基因被所需的一种或多种治疗基因所替代是至关重要的。为了避免这个问题，以及避免宿主对载体的免疫应答的可能性，也正在研究非人类的腺病毒毒株。这一点，特别是因为其与定量相关，已经被FDA特别指出：″鉴于腺病毒颗粒本身的潜在毒性，CBER建议基于颗粒数量对患者给药。″(GuidanceforHumanSomaticCellTherapy&GeneTherapy,FDACentersforBiologicsEvaluationandResearch,1998.)腺相关病毒(AAV)是一种小型、无包膜病毒家族，具有约20纳米尺寸和4.7kb单链DNA基因组。AAV具有许多能够感染人宿主中的分裂和静止细胞的血清型。腺相关病毒是用于许多病毒疗法应用的重要病毒，包括作为基因治疗载体。由于极小的体积，腺相关病毒难以检测和准确量化，例如在用于制备重组腺相关病毒和用于给药控制的制造操作中。腺相关病毒(AAV)通常是非复制型的，复制通常需要存在另外的因子。例如，可以使用一些腺病毒基因的蛋白质在腺病毒存在下复制AAV。使用AAV作为病毒载体的一些优点是不存在致病性、低宿主免疫应答和长期表达。在制造和配制操作过程中精确定量AAV对监测制造建构物的性能和跟踪产品产量以及提供准确的剂量是重要的。即使不是致病性的，感染性病毒剂如腺相关病毒的过量给药也可对患者造成严重问题。最有问题的步骤之一是在生长、收获、纯化和释放期间定量腺病毒或AAV病毒载体。诸如定量PCR和在260nm和280nm处的吸光度读数的方法是高度可变的，导致在任何给定步骤存在对颗粒过高或过低的评估。制造的后果是产品损失、延误和成本超支，这是为严重的，但仍比不上给药过少(无治疗效果)或过多(不良免疫反应)的产品相关的风险。显然，对于用于载体介导的基因治疗的AAV病毒颗粒的快速、更精确的量化方法有非常关键的需求。一些其他传统的病毒量化方法包括透射电子显微镜(TEM)和免疫单扩散(SRID)测定。这些传统方法往往具有以下一个或多个限制：耗时、昂贵、高度技术性、结果的高可变性和主观性。推荐通常用于病毒定量的一些较新的方法包括场流分级和多角度光散射(FFF-MALS)、可调电阻脉冲感测(TRPS)和纳米粒子跟踪分析(NTS)。所有这些较新的方法在某些情况下相对于传统的量化方法可以具有一些优点，但也具有限制，包括通常提供有限的病毒数据。在AAV的情况下，因为AAV的非复制性质，通常用作许多病毒的量化测量法的斑块滴度测定通常不是对AAV有用的技术。此外，因为AAV的非复制性质，通常用作许多病毒的量化测量法的斑块滴度测定通常不是腺相关病毒的有用技术。用于量化AAV的非常常见的方法是定量PCR，但是该技术通常被认为最多提供了颗粒数的间接读数，并且在相同的仪器上对相同样品进行的结果可以变化多达3倍，当样品被不同的硬件和/或不同的实验室人员进行分析时甚至更多(多达10倍)。使用qPCR的能力也常常被超过正常4.7kb基因组大小的构建体的异常包装所混淆。由于qPCR通常低估拷贝数(并且由此推断，低估了颗粒计数)，因此关于注射了超过必需量的AAV颗粒的考虑是有根据的。使用蛋白质和核酸荧光染色剂的组合进行精心控制的流式细胞术也用于定量各种病毒。流式细胞术是一种分析技术，其中随着颗粒在流体样品中流过，通过通常称为流动池的研究试管时测量颗粒的物理和/或化学性质。虽然可以通过使流体样品经受各种刺激来研究流体样品，但光是一种常见的刺激技术。含有流动池和相关流体流、光输送和光检测组件的装置通常称为流式细胞仪。已经使用Virus流式细胞仪(ViroCyt，Inc.)来检测多种病毒的游离、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.评估生物材料样品中的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，所述非缔合的病毒尺寸颗粒具有指示病毒类型的特定表位，所述病毒类型为选自：腺病毒的病毒类型和腺相关病毒的病毒类型，该方法包括:/n对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，以形成包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；/n其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品包含的未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。/n

【技术特征摘要】
20150323 US 62/137,102;20151231 US 62/273,874;20161.评估生物材料样品中的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，所述非缔合的病毒尺寸颗粒具有指示病毒类型的特定表位，所述病毒类型为选自：腺病毒的病毒类型和腺相关病毒的病毒类型，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，以形成包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品包含的未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂的浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。


2.评估生物材料样品中的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，所述非缔合的病毒尺寸颗粒具有指示病毒类型的特定表位，所述病毒类型为选自：腺病毒的病毒类型和腺相关病毒的病毒类型，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，以形成包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
在流式细胞术之前，制备流体样品，包括：
将待评估是否存在非缔合的颗粒的生物材料与荧光抗体染色剂混合，所述荧光抗体染色剂能与所述表位直接或间接结合以形成未缔合的病毒尺寸的标记的颗粒；和
在混合后，在流式细胞术之前，不从流体样品去除未结合在非缔合的标记的颗粒中的荧光抗体染色剂。


3.评估生物材料样品中的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，所述非缔合的病毒尺寸颗粒具有指示病毒类型的特定表位，所述病毒类型为选自：腺病毒的病毒类型和腺相关病毒的病毒类型，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，以形成包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中所述流式细胞术不检测光散射。


4.根据权利要求3的方法，其中所述流式细胞术包括仅检测荧光发射。


5.评估生物材料样品中的具有病毒类型的特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，所述病毒类型选自以下：腺病毒的病毒类型或腺相关病毒的病毒类型，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，以形成包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中所述荧光抗体染色剂包含附着至抗体分子的荧光团，所述荧光抗体染色剂的每个抗体分子平均包含3至8个附着的荧光团。


6.评估生物材料样品中的具有指示病毒类型的特定表位的非缔合的病毒尺寸颗粒的方法，所述病毒类型选自以下：腺病毒的病毒类型或腺相关病毒的病毒类型，该方法包括:
对包含该生物材料样品至少一部分的流体样品进行流式细胞术，其中所述流体样品包含能与特定表位直接或间接结合的荧光抗体染色剂，以形成包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和所述荧光抗体染色剂的非缔合的标记的颗粒；
其中所述荧光抗体染色剂为具有第一荧光发射响应的第一荧光染色剂，且所述流体样品包含具有第二荧光发射响应的第二荧光染色剂，该第二荧光发射响应不同于第一荧光发射响应，且所述流式细胞术包括在第一荧光发射响应的第一波长范围内以及在第二荧光发射响应的第二波长范围内检测辐射。


7.根据权利要求6的方法，其中所述第二荧光染色剂包括对颗粒类型不具有特异性的荧光核酸染色剂。


8.根据权利要求6的方法，其中所述表位为第一表位，且所述第二荧光染色剂包含能够与不同于第一表位的第二表位结合的第二荧光抗体染色剂。


9.根据权利要求6的流式细胞术方法，其中:
所述非缔合的颗粒为第一非缔合的颗粒，所述表位为第一表位，所述非缔合的颗粒为第一颗粒类型且所述非缔合的标记的颗粒为第一非缔合的标记的颗粒；且
所述第二荧光染色剂为不同于第一荧光抗体染色剂的第二荧光抗体染色剂，且该第二荧光抗体染色剂能够结合具有第二表位的第二非缔合的病毒尺寸颗粒以形成第二非缔合的标记的病毒尺寸颗粒，该第二表位指示不同于第一颗粒类型的第二颗粒类型。


10.根据权利要求6的流式细胞术方法，其中所述第二荧光发射具有的峰值波长与第一荧光发射的峰值波长有至少20纳米的不同。


11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述流式细胞术包括：
使流体样品流过流式细胞仪的流动池；
使流过流动池的流体样品经受能从荧光抗体染色剂引起荧光发射响应的激发辐射；和
在所述荧光发射的波长范围内检测来自所述流动池的辐射，并评估所检测到的辐射，以鉴定指示有非缔合的标记的病毒尺寸颗粒通过所述流动池的检测事件，该非缔合的标记的病毒尺寸颗粒包含具有所述表位的所述病毒尺寸颗粒和荧光抗体染色剂。


12.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品包含的荧光抗体染色剂的总浓度范围为0.5微克/毫升至10微克/毫升。


13.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中进样至流式细胞仪的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为至多1x109个颗粒/毫升。


14.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在流式细胞术期间进样至流式细胞仪的流体样品具有的非缔合的标记的颗粒的浓度范围为1x105至1x109个颗粒/毫升。


15.制备包含选自以下的病毒类型的病毒尺寸颗粒的产品的流式细胞术方法：腺病毒的病毒类型和腺相关病毒的病毒类...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA阿尔廷格，FK科尔迈耶，MW奥尔斯佐伊，TD盖茨，
申请(专利权)人：以埃森生物科学股份有限公司的名义经营的埃森仪器股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US