白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法。本发明专利技术针对不同的白肉灵芝菌株进行ISSR分子标记的扩增，最终找到野生白肉灵芝Z160097的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，从而找到野生白肉灵芝Z160097专有的特征性核苷酸序列，建立野生白肉灵芝Z160097的快速准确鉴定方法。野生白肉灵芝Z160097是分布范围极小的新物种，其的快速准确鉴定将为其产业化开发和产权保护奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法
：本专利技术属于分子生物学
，具体涉及白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法。
技术介绍
：灵芝是著名的药用真菌之一，千百年来一直被民间视为仙草，被历代医药家视为延年益寿、滋补强健、扶正固本的神奇珍品，经过大量临床研究，灵芝具有调节免疫、防治心血管系统疾病、抗肿瘤、保肝解毒、抗神经衰弱、降血糖等功效。灵芝属(Ganoderma)是由芬兰植物学家P.Karsten于1881年建立的，并以灵芝G.1ucidum(W.Cur.Fr.)Karst.作为本属的代表种。白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)是新发现的灵芝属中国特有种(Lietal.,2014)，是本专利专利技术人之一的胡惠萍等人于2011年在调查西藏林芝地区的野生食药用菌资源时，采集到的生长在青冈树(Cyclobalanopsisglauca)上的野生灵芝。通常夏秋季散生至群生于青冈树腐木上，靠近树干基部，分布于西藏与四川等西南地区，可药用，目前药材市场上与灵芝(俗称赤芝)(G.lingzhi)混淆使用。白肉灵芝在形态特征上与灵芝、亮盖灵芝/漆光灵芝(G.lucidum)和四川灵芝(G.sichuanense)等均较相似，因此在没有被定为灵芝属新种之前，在四川和西藏等地，采集、收购和售卖灵芝的采集者和商贩称之为“白肉灵芝”、“白灵芝”、“藏白芝”或“藏白灵芝”，在当地被视为高品质的种类，售价往往比一般的灵芝高数倍。白肉灵芝的多糖含量比普通灵芝高2-4倍，灵芝三萜含量达到普通品种120％以上，动物实验及细胞实验都表明其具有强烈的抑制肿瘤的作用。这一特点让白肉灵芝的批发价每斤一般可达400元，大约是内地普通灵芝价格的6-8倍。野生白肉灵芝Z160097栽培性状稳定良好，活性成分含量高，并且拥有自主产权，具有极好的开发利用价值。因此，快速且准确地鉴别野生白肉灵芝Z160097的方法和技术是优质野生白肉灵芝菌株商业化生产的重要技术保障，对其的开发利用具有重要的意义。DNA是生物遗传信息的载体，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。随着分子生物学技术的快速发展，真菌的快速准确检测鉴定已成为可能。目前常用的分子标记鉴定方法主要有RAPD、AFLP、RFLP、rDNA序列分析和特异性引物的PCR检测等。本专利技术旨在应用各种分子标记找到目标菌株的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，从而找到目标菌株专有的特征性核苷酸，建立目标菌株的快速准确鉴定技术方法。目前，已有部分用于鉴定真菌菌株的核苷酸特征序列获得专利，但由于野生白肉灵芝Z160097是分布范围极小的新物种，其快速准确鉴定将为其产业化开发和产权保护奠定基础。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法。本专利技术的第一个目的是提供一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列，所述的特征性核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的第二个目的是提供一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特异引物，所述的特异引物如下所示：Z97-F：5'-GGTCAACGTAGGCTACGCAG-3'(如SEQIDNO.3所示)；Z97-R：5'-GACACGCACACGAGAAAAAG-3'(如SEQIDNO.4所示)。本专利技术的第三个目的是提供一种白肉灵芝Z160097的快速鉴定试剂盒，包括上述的特异引物。本专利技术的第四个目的是提供一种白肉灵芝Z160097的鉴别方法，包括以下步骤：提取待测白肉灵芝的基因组DNA作为模板，以上述的特异引物Z97-F和Z97-R进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，若扩增出条带，则说明待测白肉灵芝是白肉灵芝Z160097，若没有扩增出条带，则说明待测白肉灵芝不是白肉灵芝Z160097。优选，所述的PCR扩增的反应体系为20μL：包括DNA模板2μL、10μmol/L引物Z97-F2μL、10μmol/L引物Z97-R2μL、2×PCRTaqmix10μL和ddH2O4μL。优选，所述的PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃45s、53℃45s、72℃30s，30个循环；72℃5min。本专利技术针对不同的白肉灵芝菌株进行ISSR分子标记的扩增，最终找到野生白肉灵芝Z160097的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，从而找到野生白肉灵芝Z160097专有的特征性核苷酸序列，建立野生白肉灵芝Z160097的快速准确鉴定方法。野生白肉灵芝Z160097是分布范围极小的新物种，其的快速准确鉴定将为其产业化开发和产权保护奠定基础。本专利技术的白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)Z160097于2020年4月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCCNo：60965。附图说明：图1是白肉灵芝成熟子实体。图2是葡萄糖的标准曲线。图3是白肉灵芝的ISSR(857)分子标记图；其中，1-24分别为表3中序号1-24的白肉灵芝菌株。图4是野生白肉灵芝Z160097的特异引物设计位点。图5是野生白肉灵芝Z160097的特异引物对特异性验证；其中，1-24分别为表3中序号1-24的白肉灵芝菌株。具体实施方式：以下结合实施例对本专利技术的具体实施方案作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于此。实施例1实验样品野生白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)Z160097和3个性状优良的市场流通菌株。具体见下表1：表1栽培菌株菌株编号来源备注Z160097西藏林芝噶郎湖野生菌株I150021西藏林芝科技局市场流通菌株I160015米林红太阳科技示范农场市场流通菌株I160016米林红太阳科技示范农场市场流通菌株实验步骤1.白肉灵芝人工栽培栽培料配方：棉籽壳31％、木屑58％、麸皮10％和碳酸钙1％，水分62％，pH自然；养菌房内25℃恒温遮光培养，约30-40天后菌丝长满菌袋，进入出芝房，控制温度在15-18℃之间，空气相对湿度85-90％之间，光照约为100-200lux，二氧化碳含量刚出芝时控制在2000ppm以上，待出原基后，温度和空气相对湿度不变，调整光照约200-300lux，继续保持二氧化碳含量在2000pp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述的特征性核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


2.一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特异引物，其特征在于，所述的特异引物如下所示：
Z97-F：5'-GGTCAACGTAGGCTACGCAG-3'；
Z97-R：5'-GACACGCACACGAGAAAAAG-3'。


3.一种白肉灵芝Z160097的快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的特异引物。


4.一种白肉灵芝Z160097的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测白肉灵芝的基因组DNA作为模板，以权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄龙花，梁晓薇，莫伟鹏，吴晓贤，卓丽君，刘远超，胡惠萍，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44