鉴定和/或定量靶化合物的方法技术

本发明专利技术涉及鉴定和／或定量从样品，优选生物样品中获得的靶化合物的方法，包括步骤：用捕获分子与该靶化合物接触，以便使所述靶化合物可以和捕获分子特异结合，所述捕获化合物根据密度为每ｃｍ↑［２］含有至少２０个离散区域的阵列被固定在固相支持物表面，所述离散区域的每一个均固定有一种捕获分子；进行反应以导致在所述结合位置形成沉淀物，确定离散区域中沉淀物的可能存在，并将这些离散区域中沉淀物的存在与所述靶化合物的鉴定和／或定量相关联。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过与固定在芯片上的捕获分子结合，鉴定和/或定量从生物样品中获得的靶化合物的方法。本专利技术还涉及基于所述方法进行鉴定和/或定量的设备，该设备使得可以鉴定和/或定量在所述芯片上结合的靶化合物的阳性位置。然而，由于所述微型化造成结合的靶化合物的量极少(几个飞摩尔或甚至几个阿摩尔)，所以对结合的靶化合物的检测是困难的。因此，只有极为灵敏的方法才足以用于该检测。已经提议用荧光分子对靶化合物例如DNA在其可能的遗传扩增之后进行标记。当必须检测RNA分子时，首先在其可能的扩增之前，将其转变为cDNA。如果直接标记该靶化合物不可行，则可以采取双反应(夹心反应(sandwich reaction))。然而，荧光分子的量极低，以致必须开发特定的阵列扫描仪用于检测和/或定量该“杂交芯片”上结合的化合物。所述昂贵的特定扫描仪含有用于激发这些荧光分子的激光扫描器、用于减少荧光背景噪音的光孔、和用于增强检测灵敏度的光电倍增器。文件US-5,821,060和WO95/04160中描述了另一种具有高灵敏度的检测方法，该方法基于采用昂贵装置例如质谱仪进行的检测。还提出了以比色标记(US5,270,167、US4,731,325，EP-A-0301141)或酶作用结果(EP-A-0393868、WO86/02733、EP-A-0063810)造成的特异产物沉淀为基础的方法。然而，由于沉淀在离该结合反应一定距离的位置发生，不能容易地将其位置与特异结合的靶化合物联系起来，故所述这些方法或是灵敏度低或是不足以检测到“杂交芯片”上的靶化合物。此外，这些酶反应沉淀物的密度也不够不透光，使得不能通过光吸收进行检测。还提出，通过用金属固定该酶反应产生的可溶性产物，之后使其沉淀，以提高该检测方法。然而，当所述酶反应的结果是可溶性产物时，沉淀物的位置和特异结合的靶化合物的检测不相关。专利技术目的本专利技术旨在提供一种鉴定和/或定量生物样品中存在(可能同时存在)的一种或多种靶化合物的新方法，该方法不存在现有技术中的缺陷。本专利技术旨在提供简单而廉价的这样一种方法，该方法通过采用固定在固相支持物表面阵列上的捕获分子，使得可以对所述靶化合物进行检测。本专利技术的最后一个目的是还提供基于所述方法的简单而不昂贵的设备，该设备可以提高对“杂交芯片”上结合的靶化合物的鉴定和/或定量。有利地，所述方法包括步骤-用捕获分子接触该靶化合物，以便使所述靶化合物可以和(相应)捕获分子特异结合，所述捕获分子按照密度为每cm2含有至少20个离散区域的阵列被固定在固相支持物表面，所述这些离散区域的每一个均固定有一种捕获分子，-进行反应，优选(化学或生物化学)催化反应，以导致在所述结合的位置形成沉淀物，-优选通过使用扫描仪，确定离散区域中沉淀物的可能存在，和-将离散区域中沉淀物的存在(沉淀模式)与该生物样品中所述靶化合物的鉴定和/或定量相关联。根据本专利技术，“杂交芯片”是允许在其一或多个表面上形成捕获分子阵列(特定模式)的任何类型固相支持物。所述固相支持物可以由玻璃、滤膜、电子器件、聚合或金属材料等构成。优选地，所述阵列含有(有利地根据特定模式存在的)特定位置，每个位置通常仅含有一种捕获分子。文件US-5,561,071中描述了在蛋白质上固定DNA链，之后与片基上位点特异性位置的特异附着。还已知，如文件GB-3319838中所述的，可以将捕获化合物和微型管连接，然后对这些微型管进行空间排列，以便产生阵列，或按文件EP-0476014、US-5,510,270、US-5,445,934、WO97/29212、US-5,605,662、US-5,632,957和WO94/22889中所述通过采用光刻技术在特定表面上获得寡核苷酸的直接合成。所有这些在固相支持物上固定捕获分子以便获得上述阵列的方法均与本专利技术相容。根据本专利技术的生物靶化合物可以存在于生物(或可以是非生物)样品例如从血液、尿、粪便、唾液、脓、血清、组织中提取的临床样品、发酵液或培养基中。优选地，必要时，在“杂交芯片”上检测和/或定量所述靶化合物之前，通过本领域技术人员已知的方法对其进行分离、纯化、切割、拷贝和/或扩增。优选地，通过金属化合物在所结合的靶化合物上的固定，或通过在酶存在时金属的还原，在结合位置获得沉淀物的形成。有利地，在胶体金存在时还原银，这使得可以在结合的靶化合物和其捕获分子之间不超过几个微米的距离内形成沉淀。根据本专利技术，阵列上的这些特定位置在长度上小于1000μm。这些位置或点优选具有10-500μm的直径，并且相隔相似数量级的距离，以致固相支持物上的阵列在1cm2表面上含有100-250,000个点。然而，也可以制备1μm或更小的点，在其上固定捕获分子。所述点或位置的形成可以通过已知的允许通过共价键合或非共价吸附将所述捕获分子固定在固相支持物表面上的微电子或光刻工艺和装置来实现。为了特异控制捕获分子固定的位点，并避免可导致在孵育或洗涤步骤中能够解吸附的若干捕获分子(如核酸或抗体)的可能缺陷，优选共价键合技术。一个优选实施方案是通过氨基键合在带有醛基部分的活化玻璃上固定生物分子如蛋白质、肽或核酸序列。采用氨基化核苷酸在核酸链的合成中可以容易地将氨基掺入其中。可以按Schena等(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93，第10614-10619页(1996))的所述方法，或按文件US-5,605,662和Krensky等(核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，15，第2891-2909页(1987))的出版物中的所述方法，将氨基化氨基酸固定在带有醛基的固相支持物如玻璃的表面上。按Joos等(Anal.Biochem.，247，第96-101页(1997))的所述方法，通过采用偶联剂如碳二亚胺化合物获得氨基和羧基的键合。还可以采用巯基修饰的寡核苷酸在存在交联分子时实现与固相支持物表面上氨基基团的反应(Thrisey等，核酸研究24，第3031-3039页(1996))。类似地，按文件US-5,552,270和WO98/28444中所述的方法，可以将寡核苷酸固定在带有羟基和醛基的凝胶例如聚丙烯酰胺上。当在最佳条件下进行时，靶化合物对其相应特异捕获分子的结合(或识别)是一个自发非共价反应。该反应涉及非共价化学结合。介质组成和其它物理和化学因素影响该结合的速率和强度。例如，对于核苷酸链的识别，低严紧性和高温度降低两条互补链之间结合的速率和强度。然而，也极大地降低了(并不是完全互补的)两条链之间的非特异结合。当几个序列相似时，结合的特异性可以通过加入少量的非标记分子来增强，这些分子将与它们互补序列竞争，但更多的是与其它的序列竞争，由此降低交叉反应的水平。结合条件的优化对于抗原/抗体或配体/受体识别也是必需的，但它们通常是十分具体的。本专利技术的一个优选实施方案采用与其它金属如金接触时Ag+的催化还原所产生的放大。目前金纳米颗粒(nanoparticules)是可获得的，而且可以容易地将它们与分子如蛋白质固定在一起。例如，链霉亲和素包被的金颗粒可在市场上获得。根据本专利技术的一个优选实施方案，采用其后可通过配对物进行识别的被标记靶分子。该被标记的分子(生物素、半抗原，..本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定和／或定量从样品，优选生物样品中获得的靶化合物的方法，包括步骤：－用捕获分子接触该靶化合物以便允许所述靶化合物和捕获分子之间可以特异结合，所述捕获分子按照密度为每ｃｍ↑［２］含有至少２０个离散区域的阵列被固定在固相支持物表面上， 所述离散区域的每一个均固定有一种捕获分子，－进行反应，导致在所述结合的位置形成沉淀物，－确定离散区域中沉淀物的可能存在，和－将此离散区域中沉淀物的存在与所述靶化合物的鉴定和／或定量相关联。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J利马科尔，J德马特奥，N赞玛提欧，I亚历山大，S海米尔斯，Y胡比昂，F德朗吉维勒，
申请(专利权)人：埃佩多夫阵列技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]