用于支睾吸虫病、肺吸虫病、猪囊尾蚴病和裂头蚴病诊断的酶联免疫吸附测定试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种ＥＬＩＳＡ试剂盒，能同时诊断华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的感染。本发明专利技术提供的试剂盒能简单、快速、准确的通过标准化方法一次同时诊断主要的组织寄生的蠕虫类寄生虫的感染。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及组织寄生虫感染的血清学诊断。更具体地，本专利技术涉及酶联免疫吸附测定(以下缩写为ELISA)试剂盒，它能同时诊断华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、卫斯特曼并殖吸虫(Paragonimuswestermani)、猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)和裂头蚴(Sparganum)的感染。
技术介绍
在韩国，人类肠道寄生虫，如人蛔虫、毛首鞭虫、犬钩虫和东方毛圆线虫(它们经常通过粪便检来被检测)，已经被明显降低，因此现在是可被忽视的。现在，这样的粪便检验仅在象医院这样的医疗机构进行。相反，迄今为止，居住于组织内的寄生虫不断地出现，因此，也变得相对越来越重要。进一步地，居住于组织内的寄生虫比肠道寄生虫引起更严重的损伤，因此，它们的感染需要一种合适的药物治疗。精确的诊断是适当治疗的第一步，因此，获得合适的诊断工具是关键。具体地，在许多发展中国家，被华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的感染是重要的地方病。很多人已经被它们感染但没有有效的治疗。超过15百万的病人所患支睾吸虫病，一般通过粪便检验进行诊断。然而，很难诊断轻度感染。而且，很多人有不愿做粪便检验的倾向。此外，皮内试验可以用于群体筛选检查，但用作诊断工具时特异性太低。因此，皮内试验倾向于被血清学试验代替。在另一方面，肺吸虫病、猪囊尾蚴病和裂头蚴病，每年有几万病人在遭受痛苦，只能通过血清学检验进行诊断。这样的血清学试验使用的ELISA包含了准备每种寄生虫抗原的步骤和使用这些抗原的步骤。当前，在韩国，几个试验室已经建立了它们自己的标准，并在自己试验室试验。然而，这种已知的方法不能被标准化。而且，这种方法一次只能检测一种寄生虫，要检测几种寄生虫要重复几次。因此，需要发展一种新的能通过简单标准化方法一次诊断主要组织内寄生虫的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术人进行了广泛的研究来解决在组织内寄生虫诊断中的在先的问题。作为结果，本专利技术人注意了抗原-抗体反应的免疫化学特性。专利技术人使用了来自华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的粗抗原，并使用人血清作为其阳性或阴性对照抗体，对支睾吸虫病、肺吸虫病、猪囊尾蚴病和裂头蚴病同时诊断。相应地，本专利技术的目的是提供一种能一次对支睾吸虫病、肺吸虫病、猪囊尾蚴病和裂头蚴病进行标准化血清学诊断的的诊断试剂盒。本专利技术涉及诊断支睾吸虫病、肺吸虫病、猪囊尾蚴病和裂头蚴病的ELISA试剂盒，其包含a)多孔平板或长条，在之上有来自华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的抗原覆盖；b)不与上述抗原反应的人血清，作为阴性对照；和c)作为阳性对照的人血清，每一种包含与上述抗原特异性反应的抗体。这个试剂盒可以进一步包含稀释和清洗溶液、结合物溶液、底物缓冲液、封闭溶液。在优选的实施方案中，稀释和清洗溶液包含了磷酸盐缓冲盐水(PBS)。结合物溶液包含了辣根过氧化物酶标记的抗人IgG山羊血清。底物是O-苯二胺(OPD)。在这个例子中，试剂盒进一步包含了过氧化氢作为氧化剂。封闭溶液包含硫酸。优选地，试剂盒分别包含作为蛋白质的来自华支睾吸虫和卫斯特曼并殖吸虫的抗原1.5-2μg/孔、以及猪囊尾蚴和裂头蚴的抗原2-2.5μg/孔。也更优选，使用前，与华支睾吸虫、猪囊尾蚴反应的血清被26倍稀释，与卫斯特曼并殖吸虫和裂头蚴反应的血清被101倍稀释。附图简述附图说明图1表示抗原覆盖在抗原覆盖平板的每一个小孔上的示意图。本专利技术的最好实施方式本专利技术提供了一种同时诊断4种一般用血清学方法检测的蠕虫类寄生虫，华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的试剂盒。更具体的，本专利技术提供了采用来自华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的抗原和包含这些抗原的抗体的人血清间的抗原-抗体反应同时诊断上述寄生虫感染的ELISA试剂盒。因此，本试剂盒的特征在于包含仅一个小平板用来诊断华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的感染。那就是说，一个96孔小平板或一个12×8孔长条，被来自华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的抗原覆盖并固定。然后，受试验者的血清被加上以诊断寄生虫感染。几种试剂是需要的，它们在这个平板的包装中以给定的量提供。这可以实现一次性标准化诊断。本专利技术的一个实施方案是包含作为样品溶液的人血清、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG山羊血清作为结合物溶液、O-苯二胺(OPD)作为底物、过氧化氢作为氧化剂的ELISA试剂盒。试剂盒包含下列内容物。它包含合适数量的抗原和未稀释的血清，血清将依据寄生虫的种类在使用前进行稀释i)有4种寄生虫抗原覆盖的小平板96孔平板或12×8孔长条ii)阴性标准血清一瓶iii)阳性标准血清相应于华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的各一瓶(共4瓶)iv)稀释和清洗溶液(5倍浓缩的)2瓶v)结合物溶液(350倍浓缩的)1瓶vi)底物缓冲液1瓶vii)底物(O-苯二胺)4.6mgviii)过氧化氢1瓶ix)封闭溶液1瓶上述内容物将在下面具体描述。(i)覆盖抗原的小平板 表196孔小平板或12×8孔长条上每孔的成分与含量 在A，B，C，D行的第一列的孔中没有覆盖抗原(ii)阴性标准血清一瓶表2一瓶阴性标准血清中的成分与含量(15μl) (iii)阳性标准血清各1瓶(共4瓶)(iii-1)华支睾吸虫阳性标准血清表3华支睾吸虫阳性标准血清1瓶(6μl)中的成分与含量 (iii-2)卫斯特曼并殖吸虫阳性标准血清表4卫斯特曼并殖吸虫阳性标准血清1瓶(2μl)中的成分与含量 (iii-3)猪囊尾蚴阳性标准血清表4猪囊尾蚴阳性标准血清1瓶(6μl)中的成分与含量 (iii-4)裂头蚴阳性标准血清表4裂头蚴阳性标准血清1瓶(2μl)中的成分与含量 (iv)浓缩的稀释、清洗溶液(10倍浓缩的)2瓶(使用前5倍稀释)表7稀释、清洗溶液1瓶(25ml)中的成分与含量 (v)稀释的(350倍)结合物溶液1瓶(使用前稀释100倍)表8稀释的结合物溶液1瓶中的成分和含量 (vi)底物稀释缓冲液1瓶表9底物缓冲液1瓶(6ml)中的成分与含量 底物缓冲液(6ml)柠檬酸-磷酸缓冲液(vii)底物1瓶表10底物(OPD)1瓶中的成分与含量 -O-苯二胺(OPD)盐酸盐(4.6mg)以粉状提供，使用前稀释于5ml PCB中。(viii)过氧化氢1瓶，包含30μl 30％未稀释溶液，在使用前稀释在底物缓冲液中至浓度为0.1％。(xi)封闭溶液1瓶表11封闭溶液1瓶(15ml)中的成分和含量 在上述试剂盒中，下列情况被认为是阳性。华支睾吸虫≥0.20；卫斯特曼并殖吸虫≥0.25；猪囊尾蚴≥0.25；和裂头蚴≥0.24。本专利技术试剂盒用下列方法制造(i)抗原覆盖平板的准备经过纯化的4种寄生虫的粗抗原覆盖在96孔平板上，封闭并干燥，然后冷藏。参照孔、阴性标准血清孔和4种阳性标准血清孔，也包括在这个平板上。在其余的孔中，21个样品被检测。也就是在A，B，C，D行的第一列的孔中没有覆盖抗原，被用做空白孔。华支睾吸虫抗原覆盖在A行的第2到第12列和E行的第1到第12列。卫斯特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴感染的ＥＬＩＳＡ试剂盒，包含：ａ）多孔平板或长条，在之上有来自华支睾吸虫、卫斯特曼并殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的抗原覆盖；ｂ）不与上述抗原反应的人血清，作为阴性对照；和ｃ） 作为阳性对照的人血清，每一种与上述抗原之一特异性反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵昇烈，蔡鍾一，洪性臺，韩信，赵一焕，
申请(专利权)人：新丰制药株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]