利用氧化还原反应的测定方法技术

本发明专利技术提供利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的方法，该方法可得到可信性优异的测定值。在所述氧化还原反应之前，在表面活性剂存在下，向样品中添加四唑妫婊衔铮耘懦鲅分泻械难斓鞍滓约把斓鞍追纸馕镒魑乖镏实挠跋欤缓笥伤霾舛ǘ韵笪镏什乖镏驶蜓趸镏剩ü趸乖从Σ舛ǜ昧浚筛貌舛ㄖ等范ㄋ霾舛ǘ韵笪镏实牧俊１痉椒梢苑乐挂虮砻婊钚约劣胙斓鞍谆煸诙幕胱牵虼巳缤迹彼荆梢砸种埔蚧胱嵌贾碌奈舛壬仙Ｋ霰砻婊钚约量梢允褂镁垩跻蚁┟训取＃?（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的方法。例如，血液中的糖基化蛋白质，特别是红细胞中的糖基化血红蛋白反映了生物体内血糖值的过去的情况，因此被作为糖尿病诊断、治疗等的重要指标。这类红细胞中的糖基化蛋白质可以如下所示利用上述氧化还原反应进行测定。首先配制红细胞溶血后的样品，将该溶血样品用果糖氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)进行处理，使之与糖基化蛋白质的糖基化部分作用而产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述糖基化蛋白质的量。然后在该样品中添加过氧化酶(以下称为“POD”)以及还原剂，将上述POD作为催化剂使上述过氧化氢和上述还原剂发生氧化还原反应。此时，如果上述还原剂使用因氧化而发色的发色性底物，则通过对该发色进行测定，可以测定上述过氧化氢量，结果可得知红细胞中的糖基化蛋白质的量。但是，血液中通常存在抗坏血酸(AsA)、胆红素等各种还原物质，红细胞中还存在有谷胱甘肽(GSH)等各种还原物质。这些还原物质也会例如还原产生的上述过氧化氢，阻碍上述氧化还原反应，或再度还原因氧化而发色的上述发色性底物而褪色。因此，存在难以准确测定红细胞中的糖基化蛋白质的量的问题。另外由于每个样品中所含的上述还原物质的浓度也不是一定的，因此也存在测定精度差的问题。为了避免这些问题，提出了将各种氧化剂添加到上述样品中的方法。例如，特开昭56-151358号公报中公开了用碘酸或高碘酸等卤素氧化物作为氧化剂的方法，特开昭57-13357号公报、特开昭57-161650号公报、特开昭59-193354号公报、特开昭62-169053号公报、特开平3-30697号公报中公开了用钴、铁、铈等金属络合物作为氧化剂的方法。因此，本专利技术的目的在于提供利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的方法，该方法可获得可信性优异的测定值。为了达到上述目的，本专利技术的测定方法利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质，其特征在于在上述氧化还原反应之前，在表面活性剂的存在下，向样品中添加四唑鎓化合物以排除上述样品中的还原物质的影响，之后通过氧化还原反应测定由上述测定对象物质产生的还原物质或氧化物质的量，由该测定值确定上述测定对象物质的量。上述四唑鎓化合物是指具有四唑环结构的化合物。另外，本专利技术中的“由测定对象物质产生的还原物质或氧化物质”是指测定对象物质本身或其中的氧化还原物质，或由测定对象物质利用氧化还原酶等产生的氧化还原物质双方。本专利技术者们发现上述传统的方法虽然排除了上述GSH、AsA这样的低分子量还原物质的影响，但并未排除蛋白质等高分子量还原物质的影响。而另一方面，如果用上述四唑鎓化合物进行处理，则不仅能排除上述低分子量还原物质，还可以排除上述高分子量还原物质，特别是血红蛋白和血红蛋白分解物(以下将两者一并称为“血红蛋白”)作为还原物质的影响。关于上述内容，本申请人正另行申请专利(特开2000-210100号公报)。然而，由于该方法虽然排除了血红蛋白等高分子量还原物质的影响，但还未能充分提高测定精度，或者希望进一步提高测定精度，本专利技术者们进行了更深入的研究。结果发现通过上述四唑鎓化合物的处理可以排除例如血红蛋白等高分子量还原物质的影响，通过将上述两者混合可以查明反应液中产生了浑浊，并且可以通过表面活性剂来防止该浑浊的发生，从而实现了本专利技术。根据本专利技术所述的测定方法，通过四唑鎓化合物排除还原物质的影响，并抑制由于上述四唑鎓化合物的处理而产生的浑浊，因此可以防止因还原物质以及浑浊双方对测定的妨碍，可以进行更高精度的测定。因而本专利技术的测定方法适用于如上所述的临床医疗等中的各种检查，特别是如果适用于糖基化血红蛋白的测定，则会提高作为糖尿病诊断等指标的可信性。本专利技术的测定方法中，上述样品是含有血红蛋白以及血红蛋白分解物的样品，优选排除上述样品中的血红蛋白以及血红蛋白分解物作为还原物质的影响。特别是可以排除样品中的血红蛋白作为还原物质的影响，并可排除因上述两者引起的浑浊。因而可以说对后面所述的血液样品是有用的测定。本专利技术的测定方法中，向样品中添加四唑鎓化合物之后，也可以再向产生了浑浊的混合液中添加表面活性剂，但从可抑制产生浑浊本身来讲，优选将上述两者同时添加，或向事先添加了表面活性剂的样品中添加四唑鎓化合物。本专利技术的测定方法中，根据上述氧化还原反应进行的测定优选对由上述反应产生的发色物质的吸光度进行测定。进行上述吸光度测定时通常以双波长测定为主要方式。上述双波长测定是将表示待测定对象物质(例如发色性底物等发色物质)的最大吸收的波长作为主波长，对上述对象物质进行测定，再将与上述主波长不同的波长作为副波长，测定其电气干扰、样品的浊度、光量的变化等，对上述主波长的测定值进行校正。因而，副波长是例如其他混在的物质不显示吸收的波长，且优选将其设定为与主波长相差至少约80nm。因此，本专利技术者们进一步研究的结果发现在不存在表面活性剂的条件下用四唑鎓化合物处理Hb，则在约700-900nm，特别是约760nm-900nm的波长处可见这些反应物的吸收，虽然用该波长测定是困难的，但如果在表面活性剂存在的条件下进行四唑鎓化合物处理，则在上述波长未见吸收。因此，如果将上述发色物质的测定波长(主波长、副波长)设定在该约700nm-900nm的吸收波长处，则不仅可以防止上述浑浊，更可不受Hb的吸收的影响，高精度地进行吸光度的测定。本专利技术的测定方法中，测定上述发色物质的吸光度的测定波长优选650-900nm，更优选650-800nm，特别优选690-760nm。另外，以上述波长为主波长时，副波长优选比上述主波长长，例如优选730-900nm，更优选800-900nm，特别优选800-850nm。本专利技术的测定方法中，优选上述表面活性剂为选自非离子型表面活性剂、烷基硫酸盐以及高分子化合物中的至少一种表面活性剂。上述非离子型表面活性剂有例如聚氧乙烯醚、脱水山梨糖醇脂肪酸酯等，优选聚氧乙烯醚。上述聚氧乙烯醚是指聚氧乙烯链和烃链以醚键连接，上述烃链有例如烷基、烷基苯基等。优选上述聚氧乙烯链的重均聚合度(N)为8-23，另一方的烃链中的碳原子数(L)为8-18；更优选上述重均聚合度(N)为8-15，烃链中的碳原子数(L)为8-16；特别优选上述重均聚合度(N)为8-10，烃链的碳原子数(L)为8-14。另外，上述烃链例如可以是直链，也可以有支链。上述聚氧乙烯醚的具体例子有例如聚氧乙烯-对-叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂基醚、聚乙二醇(9)月桂基醚等。上述脱水山梨糖醇脂肪酸酯有例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基酯等。上述烷基硫酸盐有例如月桂基硫酸钠、月桂基苯磺酸钠、2，4-二甲基苯磺酸钠等。上述高分子化合物可以使用例如水溶性明胶、支链淀粉等生物高分子化合物，以及聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮等合成高分子化合物。聚乙二醇的重均聚合度例如为100-30,000，优选600-6000。支链淀粉为多糖类，是指麦芽三糖残基通过α1-6键连接的水溶性α-葡聚糖。本专利技术的测定方法优选以0.05-5mmol/mL样品的范围添加上述表面活性剂，更优选0.1-3mmol/mL样品的范围，更加优选0.2-1.5mmol/mL样品的范围。另外，优选以0.2-15mol/mol四唑鎓化合物的范围添加上述表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的测定方法，该方法是在所述氧化还原反应之前，在表面活性剂的存在下，将四唑＊化合物添加到样品中，以排除所述样品中的还原物质的影响，然后通过氧化还原反应测定由所述测定对象物质产生的还原物质或氧化物质的量，由该测定值确定所述测定对象物质的量。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：平井香，小森胤树，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]