控制生物氧化反应的方法技术

通过包括下列步骤的方法控制生物氧化反应：（１）以预定的速率向包含生物催化剂的生物氧化反应混合物中独立地添加底物和共底物；（２）测定来自该反应混合物中的耗氧速率和二氧化碳释放速率；（３）通过解二氧化碳释放速率和耗氧速率与底物氧化化学计量、共底物氧化化学计量和任选的生物量形成化学计量建立的联立方程式确定底物和共底物的瞬时消耗速率；（４）将底物和共底物添加速率同时调整到以使产物形成速率达到最大值、而同时将共底物的使用速率减少到最低限度的底物氧化速率和共底物消耗速率。该方法提供了控制可以使用流水线技术且广泛应用于不同氧化反应的分批投料生物氧化反应的快速方式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2003年1月14日提交的同样待审查的申请顺序号60/439,991的利益，将该文献的全部内容引入本文作为参考。有关联邦政府赞助的研究或开发的声明本专利技术至少部分得到了商务部NIST-ATP合约号70NANB8H4033允许提供的资金。政府由此可以拥有本专利技术的一定权利。
技术介绍
通过直接还原分子氧，酶和微生物天然催化广泛的氧化反应。从生化观点来看，这些高度不可逆反应被视为十分剧烈，以热量形式释放很多的反应自由能。一般可以将许多不同有机底物发生生物氧化的基本机理看作首先分子氧的活化而形成高活性氧类。随后电子从底物转移至活化的氧类，使底物净氧化。来自分子氧的起始氧原子可以或不被引入有机底物而生成所需氧化产物。可以用单一酶或通过多种酶的协调作用催化该反应。许多酶和包括细胞色素、单加氧酶、双加氧酶、去饱和酶和氧化酶的酶系统能够利用分子氧的反应能以传统化学合成无法比拟的选择性和特异性用于有机底物的氧化。存在许多采用这些反应的动机，通过在底物分子中特别需要的位置上添加一个或多个化学官能基将这些反应施加在普通化学底物上。由于某些生物催化剂存在选择性和特异性，所以带有伴随产物和底物损耗的许多化学反应和纯化步骤可以得到消除。另一方面，这些反应还可以通过向分子上添加官能基以易于去除或在随后的转化步骤中进一步降解而有助于不需要的化学产物降解。在为商业目的而成功操作这些反应的过程中存在许多需要克服的障碍。在代谢方面，高活性氧类的产生是一种剧烈反应。这些反应中间体可以损害或降解生物催化剂、破坏寻求所需转化的酶活性或与底物发生非选择性反应。正如Stryer在其教科书《生物化学》(″Biochemistry″)中指出的——“危险潜伏在氧的还原中”(Dangerlurks in the reduction of oxygen)。利用分子氧的生物体天然具有清除脱离的氧自由基团的酶和酶系统。在工业发酵中发生的快速生物氧化反应中，这类基团可以压制这些清除系统的天然存在水平。结果是在涉及活细胞的生物氧化反应中，通常观察到细胞存活力快速减退和活细胞恢复(Dixon，B.，“有活力但不可培养”(″Viable butNonculturable″)-《ASM新闻》ASM News，64，372-373页，1998)。广泛的有机分子为制备许多氧化产物的生物氧化的可能底物，对氧化途经的天然底物的优选没有限制。某些底物的特征可以支配它如何与氧化催化剂合并以影响该氧化反应。所述底物可以为1)毒性的去活化的催化剂；2)挥发性的且易于以发酵罐废气而失去；3)抑制其自身氧化；4)诱导或产生不需要的副反应；5)昂贵的；将大量底物置于容器内增加了因设备故障或污染导致的批量受损的风险；6)产生非选择性氧化反应或其它反应；7)在回收或纯化产物中产生问题；8)可以与空气形成可燃性的混合物。由于这些原因，通常需要在补料分批操作方式的发酵过程中连续或以不连续计量的递增方式添加底物以便将底物累积减小到最低限度。尽管大量来源于许多生物氧化反应的在热力学上可利用的自由能量，但是这些反应倾向于高度不可逆的释放大部分反应自由能作为热量而非有用于代谢活动的形式。这是由于需要最初的代谢能量输入以便由分子氧生成还原氧类所致。为了产生这种需要的驱动所需生物氧化反应和维持生物催化剂的代谢能，将第二种底物提供给反应系统。这第二种底物通常称作共底物且可以任意选自大量常用于发酵的可发酵化合物，例如糖类、有机酸类、醇类或烃类。由于与生物-氧化底物相似的原因，需要连续或以不连续计量的递增方式添加所述共底物以便将共底物累积减小到最低限度。对底物浓度进行一定控制是本领域中公知的。例如，在制备普伐他汀的细胞色素P450介导的羟化反应中控制底物ML236B Na的浓度。错流过滤组件和蠕动泵产生滤液。通过自动HPLC定期分析该滤液而得到含水反应混合物中ML236B Na浓度的近似实时测定值。错流系统显然与可溶性底物一起充分起作用，因为菌株不形成大的颗粒且没有油性物质存在于反应混合物中。然而，针对应用于维持反应过程恒定的共底物50％葡萄糖进料没有控制。因此，对于在生物氧化领域中同时控制添加多种进料流的方法存在需求。生物氧化底物、共底物和产物通常为复合分子微溶于含水系统，所述的含水系统与生物催化剂一起构成复合的反应基质。尽管可以使用各种分析技术脱机分析产物、底物和共底物，但是这类方法在这些补料分批反应中倾向于对营养物补料的实时控制繁琐且几乎没有价值。由此促使寻找用于同时控制生物氧化反应的底物和共底物进料的快速计算机化的方法。相反，气相是相对简单的，可利用各种仪器得到气相组成的测定值。当与流至生物氧化反应和来自生物氧化反应的气体的测定值配合时，总体和组分气相平衡提供了对二氧化碳释放速率(CER)和摄氧速率(OUR)的实时测定值。在使用组分气相平衡的补料分批发酵中控制营养物进料的概念是本领域中公知的。特别地，气相组分平衡测定值已经用于计算和控制底物浓度或控制比生长速度。附图的简要描述附附图说明图1表示带有用于测定联机组分气相平衡计算值的典型仪器位置的，进入和离开生物氧化反应器的气体的流程图。另外显示了任选纯氧补充利用的可选位置。附图2表示ω-氧化途经及其与其它代谢途经的相关性。附图3表示基于ω-氧化途经中的步骤的文献数据的化学计量模型，其产生用于测定生物氧化化学计量参数的净反应。步骤中的三步涉及分子氧。附图4表示商品油酸生物氧化成二羧酸的时间过程、残留的葡萄糖浓度和残留的脂肪酸浓度。还显示了共底物(上)和底物(下)的化学计量线和操作线的构建。附图5解释了来自附图4的联机化学计量数据的数字积分，它用于验证反应化学计量和估计生物氧化反应混合物中的产物浓度。附图6是ω-氧化途经消耗的累积氧与由附图4中数据产生的二羧酸类关系的曲线图。所示的斜率验证了有关附图3中氧的总体净化学计量系数。附图7比较了使用联机反应数据与通过气相色谱法对样品的独立脱机分析的化学计量计算的反应混合物中二羧酸类的浓度。附图8是ω-氧化途经消耗的累积氧与用于烷类转化成二羧酸类而产生的二羧酸类关系的曲线图。烷类需要两次通过需要3摩尔氧的ω-氧化途经。附图9表示商品油酸生物氧化成二羧酸类的时间过程。附图10表示在不控制生物氧化反应的情况下商品油酸生物氧化成二羧酸类的时间过程。专利技术概述本专利技术涉及，包括下列步骤(1)以预定的速率向包含生物催化剂的生物氧化反应混合物中独立地添加底物和共底物；(2)测定来自该反应混合物中的耗氧速率和二氧化碳释放速率；(3)通过解二氧化碳释放速率和耗氧速率与底物氧化化学计量、共底物氧化化学计量和任选的生物质形成化学计量建立的联立方程式确定底物和共底物的瞬时消耗速率；(4)将底物和共底物添加速率同时调整到以使产物形成速率达到最大值、而同时将共底物的使用速率减少到最低限度的底物氧化速率和共底物消耗速率。本专利技术的方法提供了控制补料分批生物氧化反应的可以使用计算机技术且广泛应用于不同反应的快速方式。不需要如同使用已知方法中的情况而使用高度精确的动力学模型。也不需要用于定义本专利技术平衡状态的化学计量模型具有高度精确性。化学计量模型仅需要反映出用于定义一般平衡状态的生物氧化反应，因为底物和共底物进料速率遵循操作线本文档来自技高网...

【技术保护点】
控制生物氧化反应的方法，包括下列步骤：　　　　（１）以预定的速率向包含生物催化剂的生物氧化反应混合物中独立地添加底物和共底物；（２）测定来自该反应混合物中的耗氧速率和二氧化碳释放速率；（３）通过解二氧化碳释放速率和耗氧速率与底物氧化化学计量、共底物氧化化学计量和任选的生物量形成化学计量建立的联立方程式确定底物和共底物的瞬时消耗速率；（４）将底物和共底物添加速率同时调整到以使产物形成速率达到最大值、而同时将共底物的使用速率减少到最低限度的底物氧化速率和共底物消耗速率。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：KW安德森，JD温泽尔，
申请(专利权)人：科宁公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]