一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法技术

一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法，属于生物技术领域。通过对鸡LncPGCR的启动子克隆、核心调控区域选定、检测组蛋白乙酰化对鸡LncPGCR启动子活性的影响进行了探究，为进一步研究鸡LncPGCR的表达调控机制奠定基础。本发明专利技术的方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。实验者两个月就能完成。本发明专利技术将组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的研究扩展到家禽领域，并准确定位到鸡LncPGCR上，刷新了不同物种中组蛋白乙酰化调节LncRNA表达进而发挥功能的范畴。

【技术实现步骤摘要】
一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法
本专利技术涉及一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法，属于生物

技术介绍
LncRNA的转录受到严格的调控，其表达谱细胞特异性和组织特异性甚至高于蛋白编码基因。寻找和发现在不同生物过程中LncRNA表达变化的原因，了解LncRNA上游调控机制，是LncRNA研究领域重要组成部分，而表观遗传学正是从基因组层面研究RNA转录调控的重要领域。启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异性结合，并启动基因转录的DNA序列，是转录调控最重要的结构。乙酰化可以通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，增加组蛋白与DNA的排斥力，从而调节基因转录。然而对于组蛋白乙酰化对LncRNA基因的调控作用研究的却不多，也没有特殊的模型方法用于构建组蛋白乙酰化对LncRNA的调控网络，因此，本专利技术对于更好地理解LncRNA的功能至关重要。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法。本专利技术的技术方案如下：通过对鸡LncPGCR的启动子克隆、核心调控区域选定、检测组蛋白乙酰化对鸡LncPGCR启动子活性的影响进行了探究，为进一步研究鸡LncPGCR的表达调控机制奠定基础。本专利技术的有益效果如下：本专利技术的方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。实验者两个月就能完成。本专利技术将组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的研究扩展到家禽领域，并准确定位到鸡LncPGCR上，刷新了不同物种中组蛋白乙酰化调节LncRNA表达进而发挥功能的范畴。具体实施方式本专利技术中所需原材料(括号为厂商)：新鲜受精蛋(扬州翔龙禽业发展有限公司)，DMEM(Hyclone，SH30022.01)，胎牛血清(Gibco，10099141)，青链霉素(Solarbio,P1400-100)，DF1细胞系为本实验室冻存，pEGFP-N1、PGL3-Basic和pRL-SV40等质粒及菌液为本实验室保存，感受态DH5α(天根)，GelExtractionKit(天根)，质粒小量提取试剂盒(天根)，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根)，FastMutagenesisSystemKit(北京全式金)，MaxDNAPolymerase，rTaqDNAploymerase(Takara)，pMD19-T(Simple)载体试剂盒(Takara)，T4DNA连接酶(Takara)，SnaBI、KpnI和XhoI限制新内切酶(NEB)，TreliefTMSoSooCloningKit(北京擎科新业)，Endo-freeplasmidMiniKit(Omega)，ReporterassaySystem(Promega)，HDTransfectionReagent(Promega)，TSA(Sigma)。本专利技术具体步骤为：1.鸡LncPGCR启动子区域的生物学信息学分析根据测序得到的LncPGCR序列，利用UCSC(http://genome.ucsc.edu/)比对，下载LncPGCR序列前后3000bp基因组，根据启动子核心启动子原件TATA盒和CAAT盒在编码区5’端确定启动子区域以及转录起始位点。以转录起始位点A为+1位设计引物扩增相应片段。根据质粒图谱设计引物并引入酶切位点SnaBI和XhoI克隆启动子最长片段(1614bp)并置换EGFP-N1载体中的CMV启动子；固定下游引物，分别设计分段扩增引物，引入酶切位点KpnI克隆不同长度缺失片段并连入PGL3-basic载体中。引物由上海生工公司合成。2.构建鸡LncPGCR启动子真核表达载体鸡LncPGCR启动子区域克隆以4.5d鸡胚为试验材料，提取全基因组DNA作为扩增模板进行PCR扩增，将全部PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，将含有目的片段的条带切下，用DNA纯化回收试剂盒纯化回收目的片段。用限制性内切酶SnaBI和XhoI分别对纯化后的产物及真核表达载体pEGFP-N1进行双酶切消化。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。将纯化后的目的片段和载体按摩尔比3:1的比例用T4DNA连接酶连接后转化、挑菌、摇菌并测序。将测序正确的重组质粒命名为pLncPGCR-EGFP。3.鸡LncPGCR启动子活性定性分析液氮中取出DF-1细胞冻存管，迅速置于37℃水浴融化。用10倍体积的DMEM(含10％FBS)稀释细胞，1000rpm离心8min，弃上清，用新鲜培养基重悬沉淀，接种于培养皿中，生长至汇合度70-80时传代，传代2-3次后细胞用于细胞转染。将pLncPGCR-EGFP阳性菌液接种于含卡那抗生素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养12-14h，参照Omega公司的去内毒素质粒小提试剂盒Endo-freeplasmidMiniKit说明提取去内毒素pLncPGCR-EGFP质粒。细胞转染前一天将DF-1细胞接种于24孔板中，每孔105个细胞，细胞生长汇合度至70％左右进行转染实验。具体实验分组如下：实验组：转染pLncPGCR-EGFP；对照组转染pEGFP-N1载体。转染试剂为：Fugene，转染体系为：质粒(质量)：转染试剂(体积)＝1:3。转染体系配制好后37℃孵育5-10min，加入细胞中，轻轻混匀。24-48h后于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。4.鸡LncPGCR核心启动子区域的鉴定以pLncPGCR-EGFP为模板，PCR克隆LncPGCR不同长度的启动子片段，构建重组双荧光素酶表达载体。用限制性内切酶KpnI和XhoI分别对纯化后的不同缺失片段的克隆产物和亚克隆产物以及PGL3-Basic载体进行双酶切消化，分别回收纯化目的载体和目的片段，16℃连接16h后，转化感受态细胞扩增，提取质粒，酶切鉴定正确，送上海生工生物工程有限公司测序。以双荧光素酶报告基因检测系统检测LncPGCR启动子的启动活性，具体试验步骤简述如下：1)细胞转染：将包含不同启动子片段的重组质粒和pRL-SV40以30:1的比例共转染DF1细胞，同时以30:1的比例共转染质粒pGL3-Basic空载体和pRL-SV40作为对照。每次转染3个孔，重复3次；2)收集细胞：去掉DF1细胞培养基，以预冷的PBS清洗，加入胰酶消化2-3min，至细胞脱落后加入含10％血清的培养基终止消化，1200r/min离心6min，弃掉上清，每个孔的细胞最终用DMEM或PBS稀释至75μL，移入96孔细胞检测平板中；3)双荧光素酶报告基因活性检测：每个96孔细胞中加入等体积及75μL细胞裂解液，轻摇混匀，室温放置10min。放入酶标仪中读取萤火虫荧光值，记录3次读取结果；然后加入70μLSTOP终止液，轻轻吹打混匀，室温放置10min，再放入酶标仪中读取海肾荧光值，记录3次读取结果。相对荧光活性的数值为3次重复试验结果的平均值±标准差本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法，其特征是，通过对鸡LncPGCR的启动子克隆、核心调控区域选定、检测组蛋白乙酰化对鸡LncPGCR启动子活性的影响进行了探究，为进一步研究鸡LncPGCR的表达调控机制奠定基础。/n

【技术特征摘要】
1.一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA表达的方法，其特征是，通过对鸡LncPGCR的启动子克隆、核心调控区域选定、检测组蛋白乙酰化对鸡LncPGCR启动子活性的影响进行了探究，为进一步研究鸡LncPGCR的表达调控机制奠定基础。


2.根据权利要求1所述的一种研究组蛋白乙酰化调节鸡LncRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：左其生，姜景译，李碧春，袁霞，丁颖，张晨，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32