Mdm2和p53蛋白相互作用检测体系制造技术

Mdm2蛋白功能检测组合物或试剂盒，其特征在于，所述组合物或试剂盒包括dCas9‑Mdm2融合蛋白的编码基因、p53‑转录激活因子(例如p53‑VP64‑P65‑Rta(VPR))融合蛋白的编码基因、sgRNA的转录基因和报告基因，所述sgRNA用于引导dCas9‑Mdm2蛋白靶向所述报告基因，任选地所述基因构建在一个或多个(例如1、2、3、4个)表达载体上。本发明专利技术能够检测Mdm2的功能，尤其是在哺乳细胞动物中，以及利用改变nutlin‑3a的浓度调控Mdm2和p53蛋白相互作用。

【技术实现步骤摘要】
Mdm2和p53蛋白相互作用检测体系
本专利技术涉及生物
，具体涉及Mdm2和p53蛋白相互作用检测体系。
技术介绍
一、基因转录调控基因调控是指对从基因到蛋白质表达过程的调节，实现基因调控的途径可以分为三个方面：转录水平的调控、转录后水平的调控以及翻译水平的调控。其中，转录水平调控是基因表达调控的重要环节。真核生物的转录是通过RNA聚合酶和相关转录因子以及一些调控元件共同作用实现的。而只有当染色质处于一定状态(即具有可及性)时才能够被转录因子结合，进行调控转录。因染色质的可及性受DNA修饰和组蛋白的影响，通过可编程的DNA靶向结合技术，加上转录效应元件，能够干扰DNA和组蛋白修饰，从而改变染色质可及性，实现转录调控。研究中常用的DNA结合蛋白域(DBD)包括锌指蛋白(ZFPs)、TALEs和CRISPR/Cas9系统。ZFPs和TALEs是模块化的DNA结合蛋白，通过设计，能够使其氨基酸侧链特异性结合DNA序列，结合效应元件可以靶向结合DNA序列并调控其转录。CRISPR/Cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体，它能够在sgRNA的引导下定点切割与sgRNA碱基互补配对的DNA序列。通过对Cas9的突变分析发现，突变体(dCas9)丢失了核酸内切酶活性，但仍保留sgRNA引导的DNA结合能力。利用dCas9的这一特性，结合一些转录效应元件，可以构建一个靶向结合DNA并调控下游基因转录的体系，从而实现转录水平上的基因调控。在细胞中多种的效应元件中，比较有效的有VP64，P65，p300，KRAB，Rta等。VP64是病毒转录激活域VP16的四聚体，它能够募集重塑因子，提高染色质可及性。P65是人NF-κB复合物的亚基，它能够募集转录激活因子，和ZFPs，TALEs或dCas9结合可以激活靶标基因的转录。Rta是来自Epstein-Bar病毒的反式激活因子。另外，还有一些具有酶催化活性的结构域，如乙酰转移酶p300催化域，DNA去甲基酶TET1催化域和TDG去甲基酶，它们通过对DNA和组蛋白的作用，改变染色质的可及性，结合DBDs，可以实现转录激活。相反地，box(KRAB)作用于DNA能够诱导异染色质重塑复合物形成，同时抑制邻近及远端的基因调控元件，如增强子，进而抑制转录。研究表明，将这些效应元件与CRISPR体系结合，可以实现内源和外源基因在转录水平上的定向调控。此外，将多个调控因子串联形成融合蛋白，如VP64-P65-Rta，可以大大提高转录调控的能力。为了实现对基因表达的精确控制，设计能够响应外界环境变化的调控体系。如doxycycline控制的表达系统，被广泛用于转录的瞬时调控。在dCas9-VP64转录激活体系中加入可化学诱导结构域，就能够实现响应小分子化合物的转录调控。在CRISPR/dCas9转录调控体系中引入可响应远红光的c-di-GMP合酶，可促进c-di-GMP的合成，从而激活效应元件的转录，进一步实现CRISPR/dCas9对靶标下游基因的调控。Gao等人通过脱落酸或赤霉素在细胞内诱导形成相应的蛋白-小分子-蛋白复合体，结合CRISPR/dCas9，能够实现转录激活或抑制，进一步的，构建复杂的逻辑运算体系(Gao，Y.etal.ComplextranscriptionalmodulationwithorthogonalandinducibledCas9regulators.Naturemethods13，1043-1049(2016))。二、蛋白质相互作用及检测蛋白质作为生命物质的基础，几乎控制和调节着细胞的一切生命活动，而其中超过80％的蛋白质是以复合物的形式参与生命活动的。细胞内的生长代谢等多方面都涉及到蛋白质分子相互作用，其中包括蛋白酶复合体的组装、抗原-抗体反应、核糖体等超分子结构的组装以及细胞表面受体与生长因子和激素的相互作用；此外，蛋白质分子间的相互作用也会参与到肿瘤形成中。因此，研究蛋白质的功能一个主要的途径就是研究蛋白质分子间相互作用和作用网络。研究蛋白质-蛋白质相互作用不仅能够从分子水平揭示蛋白质的功能，更有助于了解细胞生长、发育、分化和凋亡等生命活动，进而为探讨重大疾病机制、疾病治疗和预防以及新药开发提供重要的理论基础。现有的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法可分为三种：体外检测、体内检测和生物信息学研究方法。其中体内方法提供了唯一的一种途径，能够还原被检测蛋白产生相互作用的细胞环境，原位检测蛋白质相互作用变化，其主要包括酵母双杂交技术(Y2H)及由此衍生的哺乳动物细胞双杂交技术(M2H)、荧光共振能量转移(FRET)、信号蛋白邻近成像法(PRIM)等。Y2H是一种基于转录激活的检测系统。整个体系包括两类蛋白，一类是目的蛋白‘X’与DNA结合结构域的融合蛋白(DBD-X)，一类是目的蛋白‘Y’与转录激活结构域的融合蛋白(AD-Y)，当两个目的蛋白相互作用时，AD-Y融合蛋白被DBD-X融合蛋白招募到报告基因的转录激活区域附近，从而能够进行筛选和鉴定。Y2H的优势在于灵敏度高，而且过程较为简捷；此外，使用Y2H还可以从蛋白质库中筛选与已知蛋白相互作用的新蛋白。但同时，Y2H也存在着缺陷：对于某些存在于非酵母细胞中的蛋白对相互作用而言，在酵母细胞中可能会由于受到异于正常生理状态的刺激而产生假阴性结果，且实验不能完全模拟目标蛋白所在的细胞类型、细胞空间和生长发育的不同时期，所以不能用于研究在特定细胞条件下发生的蛋白相互作用。由此发展出M2H，其作用原理与Y2H相同，但效应元件与酵母细胞中所用不同，可用于哺乳动物细胞中原位检测蛋白质间的相互作用。荧光共振能量转移(FRET)检测蛋白质之间相互作用是依靠供体和受体荧光分子之间的偶极-偶极耦合过程。当两种蛋白(A和B)由于相互作用而靠近时，B所连接的受体荧光分子受激发射荧光，同时A所连接的供体荧光分子荧光消失或减弱，由此可以推断蛋白质间的相互作用。FRET的优势在于能够用于原位检测活细胞中的蛋白质相互作用，但对供体和受体荧光物质的要求较严格：供体的发射光谱需和受体的激发光谱有明显的重叠，且两者的发射光谱要完全分开。此外，由于该方法的关键就在于供体和受体荧光分子的距离关系，所以需要设计合适的linker连接荧光分子和待检测蛋白，而这一步需要大量的实验验证优化，所以该体系较难构建。信号蛋白邻近成像法(PRIM)的原理是，当蛋白质间存在相互作用时，两种蛋白所连接的信号蛋白会发生重组并产生信号，通过检测重组蛋白的信号变化就可以推测蛋白质间相互作用的变化。所用的信号蛋白有荧光蛋白及荧光素酶等。这种检测方式存在一些问题：只有当荧光蛋白以正确的方式组装时才能够产生荧光信号，所以导致荧光信号较弱，对于一些弱的相互作用较难检测到。三、Mdm2和p53蛋白p53是一种肿瘤抑制因子，它参与调控细胞中最重要的过程，其活性和稳定性主要体现在转录后的共价修饰来应对各种形式的应激。在绝大多数人类癌症中，p53的活性不是丧失了，就是减弱了。它对很多靶基因都有转录激活作用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于Mdm2蛋白功能检测的组合物或试剂盒，其特征在于，所述组合物或试剂盒包括dCas9-Mdm2融合蛋白的编码基因、p53-转录激活因子(例如p53-VP64-P65-Rta(VPR))融合蛋白的编码基因、sgRNA的转录基因和报告基因，所述sgRNA用于引导dCas9-Mdm2蛋白靶向所述报告基因，任选地所述基因构建在一个或多个(例如1、2、3、4个)表达载体上。/n

【技术特征摘要】
1.用于Mdm2蛋白功能检测的组合物或试剂盒，其特征在于，所述组合物或试剂盒包括dCas9-Mdm2融合蛋白的编码基因、p53-转录激活因子(例如p53-VP64-P65-Rta(VPR))融合蛋白的编码基因、sgRNA的转录基因和报告基因，所述sgRNA用于引导dCas9-Mdm2蛋白靶向所述报告基因，任选地所述基因构建在一个或多个(例如1、2、3、4个)表达载体上。


2.根据权利要求1所述的组合物或试剂盒，其中dCas9与Mdm2蛋白的编码基因之间，以及p53与VPR蛋白的编码基因之间均通过连接链的编码基因连接，形成两种融合蛋白的表达基因。


3.根据权利要求1或2所述的组合物或试剂盒，其中所述Mdm2蛋白的编码基因的序列如SEQIDNO.1所示，所述p53蛋白的编码基因的序列如SEQIDNO.2所示，和/或所述连接链的编码基因的序列如SEQIDNO.3所示。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物或试剂盒，所述报...

【专利技术属性】
技术研发人员：付瑜，何苗，梁好均，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34