中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法技术

本发明专利技术适用于蜜蜂嗅觉系统分析技术领域，提供了中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，选用中华蜜蜂气味受体AcerOr1作为研究对象，从体内外探讨了它潜在的生物学功能。对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测发现其亚细胞定位于细胞膜。膜拓扑结构预测发现AcerOr1的序列结构上没有预测到有钙调蛋白结合位点区域和气味配体离子门控通道的存在。成功构建真核表达载体pIB/V5‑AcerOr1并建立稳定转染细胞系；Western blot结果证明重组后的真核表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达；免疫荧光显示重组后的真核表达载体在Sf9细胞膜上表达，与预测结果一致。AcerOr1能够和Sf9内源性Orco在Sf9细胞膜上形成离子通道，与传统气味受体形成异源二聚体具有气味配体门控通道的作用，当细胞受到外界刺激后，能引起Ca

【技术实现步骤摘要】
中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法
本专利技术属于蜜蜂嗅觉系统分析领域，尤其涉及中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法。
技术介绍
中华蜜蜂依赖其灵敏的嗅觉系统在周围环境中觅食。气味受体的一个主要功能是对气味的识别和编码，这些受体结合不同的气味分子，产生信号级联，打开离子通道，并从嗅觉感觉神经元向大脑发送电信号。与哺乳动物G蛋白偶联受体相比，昆虫OR具有与之既然相反的7个跨膜拓扑结构，即C末端在胞外端，N端在细胞内，它们与哺乳动物气味受体间没有同源性。在体内，气味受体主要在嗅觉神经元表达，参与了嗅觉识别的初始过程。每个嗅觉神经元表达两类气味受体：高度保守的共受体Orco和传统的气味受体。Orco不能识别气味分子，但是它可以帮助传统气味受体在树突膜上的折叠和正确定位，且在不同昆虫间高度保守。传统气味受体则在不昆虫间差异较大。随着转录组测序广泛应用，越来越多的ORs被鉴定出来，但是受体的配体鉴定仍然很落后，导致许多气味受体仍然是孤儿受体。经转录组测序在中华蜜蜂体内已经鉴定出119个气味受体，意大利蜜蜂鉴定出超过177个气味受体，但是到目前为止只在意大利蜜蜂上鉴定出少数几个气味受体的配体，意大利蜜蜂Or151在工蜂中高表达并能结合芳樟醇；AmOr11在雄蜂中表达并特异性识别9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)；表明蜜蜂嗅觉受体结合气味与气味检测环境有关。
技术实现思路
本专利技术提供中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，旨在解决利用体外异源表达的细胞对中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1功能进行分析验证。本专利技术是这样实现的，中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，包括以下步骤：S1、亚细胞定位及跨膜结构域预测；S2、设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物，扩增PCR；S3、构建真核表达载体pIB/V5-AcerOr1；S4、将所述重组表达载体用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞；S5、Westernblot检测目的蛋白的表达；S6、细胞免疫荧光鉴定目的蛋白的的亚细胞定位；S7、运用钙离子成像实验，检测目的蛋白AcerOr1潜在的功能活性。优选的，所述利用在线网站http://linux1.softberry.com/all.htm对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测。优选的，将所述通过HMMTOP2.0和TMHMM2.0对中华蜜蜂气味受体AcerOr1的跨膜结构域进行预测。优选的，所述设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物，扩增PCR，具体为：根据NCBI中AcerOr1(JN792580)序列设计并扩增CDS区，插入到pIB/V5-His质粒载体的BamHI和EcoRI位点，用PrimerPremier6.0设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基(下划线部分)的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物：AcerOr1_F：CGCGGATCCATGGAAAATACCACGAATTATCGTA；AcerOr1_R：CCGGAATTCTACCGTCATTGCACGCAGAA；引物交由华大基因合成。根据TaKaRa的SYBRPremixExTaqTMT试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR。反应体系总体积为20μL，每个组织样本重复测定3次。优选的，所述构建真核表达载体pIB/V5-AcerOr1，具体为：将pIB/V5-His载体及PCR回收产物分别经BamHI和EcoRI双酶切，胶回收目的基因片段和载体片段，经T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态细菌JM109，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，酶切鉴定及测序鉴定，鉴定成功的质粒命名为pIB/V5-AcerOr1。优选的，将所述重组表达载体转染Sf9细胞，Westernblot检测AcerOr1蛋白在Sf9细胞上的表达，具体为：分别以pIB/V5-AcerOr1及pIB/V5-His用脂质体转染Sf9细胞，以未转染正常Sf9细胞作为空白对照组；待细胞汇合度达到80-90％时，用脂质体CellfectinIIReagent转染细胞；转染后48h收集细胞蛋白，经12％SDS-PAGE凝胶电泳分离，半干转转至NC膜上，5％脱脂奶粉封闭1.5h，TBST洗膜；TBST稀释的一抗AcerOr1(1∶1000)4℃过夜孵育，TBST洗膜，二抗孵育2h，TBST洗膜，显微镜下拍片观察。优选的，所述细胞免疫荧光鉴定AcerOr1蛋白在Sf9细胞上的亚细胞定位，具体为：细胞转染48h后，弃去培养液；加入4％多聚甲醛溶液，室温固定15min。用1％BSA室温封闭1h，PBS洗2次，每次5min；加入1：500稀释的一抗，37℃孵育1.5h或4℃过夜；加入1：200稀释的Alexa488荧光二抗，室温避光孵育1h，最后加入DAPI复染10min细胞核；在显微镜下拍片观察细胞，从而鉴定AcerOr1蛋白在Sf9细胞上的亚细胞定位。优选的，所述细胞内Ca2+成像检测目的蛋白AcerOr1潜在的功能活性，具体为：分别使用重组真核表达载体及空载体转染细胞，培养48h后进行Ca2+检测；将培养板从细胞培养箱中取出；实验中所有试剂加入细胞培养板时候需要提前27℃预热，以免刺激细胞；弃去培养细胞中的培养液，使用D-Hanks洗涤细胞，加入Fluo4-AM钙指示剂覆盖细胞，在28℃培养箱中避光孵育30min，除去工作液；加入D-Hanks洗涤；加入各种气味物质作用15min，弃去液体，D-Hanks洗涤细胞3次；使用全波长扫面多功能酶标仪检测在激发波长488nm和发射波长526nm下的F荧光强度，根据公式：计算各组细胞内Ca2+；其中[Ca2+]i是细胞内Ca2+浓度，Kd是解离常数(360nmol/L)。F是样本荧光强度，Fmax是加入破膜剂TritonX-100(终浓度为1％)后测得的荧光强度比值，Fmin是加入破膜剂TritonX-100基础上又加入EGTA(终浓度为5mM，pH为8.5)测得的荧光强度比值。据报道Sf9细胞内源性共受体Orco能够在细胞膜上与传统气味受体形成具有气味配体门控通道的作用异源二聚体(OrX+Orcoheteromericcomplex)。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，选用中华蜜蜂气味受体AcerOr1作为研究对象，从体内外探讨了它们潜在的生物学功能。对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测发现其亚细胞定位于细胞膜。膜拓扑结构预测发现AcerOr1的序列结构上没有预测到有钙调蛋白结合位点区域和气味配体离子门控通道的存在。通过将气味受体AcerOr1构建真核表达载体后转染Sf9细胞，结果表明重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，其特征在于：亚细胞定位及跨膜结构域预测，包括以下步骤：/nS1、利用在线网站http://linux1.softberry.com/all.htm对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测。/nS2、利用依据TMHMM和HMTOP预测AcerOr1的跨膜结构域。/n

【技术特征摘要】
1.中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，其特征在于：亚细胞定位及跨膜结构域预测，包括以下步骤：
S1、利用在线网站http://linux1.softberry.com/all.htm对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测。
S2、利用依据TMHMM和HMTOP预测AcerOr1的跨膜结构域。


2.中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，其特征在于：AcerOr1在Sf9细胞中的表达，包括以下步骤：
S1、设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物，扩增PCR；
S2、构建真核表达载体pIB/V5-AcerOr1；
S3、构建好的真核表达载体转染Sf9细胞；
S4、Westernblot检测AcerOr1蛋白在Sf9细胞上的表达；
S5、细胞免疫荧光鉴定AcerOr1蛋白在Sf9细胞上的亚细胞定位；
S6、运用钙离子成像实验，验证表达蛋白是否具有识别特异性气味配体的生物活性。


3.如权利要求1所述的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，其特征在于：
利用在线网站http://linux1.softberry.com/all.htm对AcerOr1蛋白结构亚细胞定位进行预测。利用TMHMM和HMTOP预测AcerOr1的跨膜结构域。


4.如权利要求2所述的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，其特征在于：所述设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物，扩增PCR，具体为：
根据NCBI中AcerOr1(JN792580)序列设计并扩增CDS区，插入到pIB/V5-His质粒载体的BamHI和EcoRI位点，用PrimerPremier6.0设计含有酶切位点BamHI和EcoRI保护碱基(下划线部分)的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1的上、下游引物：
AcerOr1_F：CGCGGATCCATGGAAAATACCACGAATTATCGTA；
AcerOr1_R：CCGGAATTCTACCGTCATTGCACGCAGAA；
反应体系总体积为20μL，每个组织样本重复测定3次。


5.如权利要求2所述的中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOr1体内外功能分析的实验方法，其特征在于：所述构建真核表达载体pIB/V5-AcerOr1，具体为：
将pIB/V5-His载体及PCR回收产物分别经BamHI和EcoRI双酶切，胶回收目的基因片段和载体片段，经T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态细菌JM109，筛选阳性克隆，提取质粒，送由华大基因进行核...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭丽娜，赵慧婷，杜亚丽，马卫华，姜玉锁，徐兵，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14