一种HTLV-1 Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，尤其涉及一种HTLV‑1 Env介导的细胞‑细胞融合模型、制备方法及应用。本申请中获得HTLV‑1 Env基因片段，并替换载体pSRHS‑Tat‑Env

【技术实现步骤摘要】
一种HTLV-1Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用
本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种HTLV-1Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用。
技术介绍
人类T淋巴细胞白血病1型病毒(HTLV-1)，最先由美国国立癌症研究所的罗伯特·盖洛研究组于1980年报道发现，为首个证明与人类癌症直接相关的逆转录病毒。目前全球范围内的感染者超千万，其感染可诱发成人T细胞白血病(ATL)和HTLV-1相关脊髓病变(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(也称为强直性下肢轻瘫，TSP)等多种疾病。尽管经过40年的研究，但至今仍没有针对HTLV-1感染的特效疗法和安全持久有效的疫苗制剂，HTLV-1感染仍是严重威胁人类健康的地方性流行病，并给全球社会经济发展造成很大压力。进入抑制剂是一类重要的抗包膜病毒药物，它在病毒感染早期阶段阻断病毒复制的中心环节——入侵靶细胞，既能预防病毒感染，也能阻止病毒感染新的宿主细胞，降低血浆中的病毒载量，具有明显的优越性，越来越受到科研人员和药物研发人员的关注和重视，具有成为HTLV-1病毒感染有效疗法的潜力。新的强效进入抑制剂的筛选和鉴定对于人类的健康与社会的发展有着重要意义。病毒是结构极其简单的微生物，无完整的代谢酶系统，需要借助宿主细胞合成自身物质，进而完成自身的生命周期。HTLV-1也是一种包膜病毒(又称囊膜病毒)，首先要通过膜融合入侵到宿主细胞内才能起始新的生命周期，因而是整个病毒复制周期的首要环节。包膜病毒一般通过两种方式进入宿主细胞。第一种方式，位于病毒表面的包膜糖蛋白与受体结合，诱导构象变化，导致病毒包膜和宿主细胞膜在细胞表面直接融合。第二种方式，病毒通过内吞途径入侵细胞，定位于胞内体，以pH和(或)蛋白酶依赖的方式触发包膜糖蛋白的构象变化，从而触发膜融合。很久之前科研人员就发现，与人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)不同，游离的HTLV-1病毒粒子对CD4+T淋巴细胞的感染效率十分低下，这种情况适用于除树突细胞以外的大多数HTLV-1靶细胞类型。近期的研究发现，游离的HTLV-1病毒粒子可以高效地感染树突细胞。同时，被感染的树突细胞可以快速地、重复性地将HTLV-1转移给自体CD4+T细胞，造成CD4+T细胞的长期多产性感染，并导致T细胞的白介素-2非依赖性的转化。树突细胞作为重要的抗原呈递细胞，被认为是多种病原入侵后最先遭遇的细胞，因而很可能在HTLV-1的传播过程中起着关键作用。Alais等人通过精巧的实验证明了树突细胞比自体淋巴细胞对HTLV-1的感染更敏感，并可有效地将病毒传递给淋巴细胞。因而，树突细胞作为体内最先被HTLV-1感染的细胞，它很可能代表着一个真正的病毒库。游离的HTLV-1病毒入侵树突细胞等靶细胞是由病毒包膜糖蛋白Envelope(Env)介导的。HTLV-1Env属于I型跨膜蛋白，以488个氨基酸的前体蛋白形式于糙面内质网中合成、折叠并伴随着寡聚化和初始糖基化，随后被输送到高尔基体中，经furin样蛋白酶家族剪切形成成熟的表面糖蛋白gp46和跨膜糖蛋白gp21，酶切后gp46和gp21仍非共价地联系在一起形成异二聚体，最后形成由三个gp46分子和三个gp21分子构成的三聚体刺突。其中，gp46含有受体结合区域，决定病毒的嗜性，起始病毒的感染；gp21含有三聚化结构域，主导Env的三聚化，还含有膜融合结构域，介导病毒和细胞的膜融合过程，完成病毒入侵。与此相对应的是，位于靶细胞表面的Env三聚体可以介导靶细胞与受体表达细胞之间的融合，形成多胞体。此外，大量研究表明Env对HTLV-1病毒突触的形成十分重要，因此，Env在HTLV-1的细胞-细胞传播过程中同样起着十分重要的作用，并且与诱导合胞体形成的能力相关联。HTLV-1Env在病毒的复制周期、细胞嗜性和致病性中起着至关重要的作用，因而是最重要且最有希望的潜在疫苗组分和重要的抗病毒药物靶点。针对HTLV-1Env的进入抑制剂能够抑制HTLV-1病毒进入靶细胞，进而在感染的最初环节抑制病毒的传播，因而是HTLV-1感染早期治疗和预防的最佳方式之一。高效准确的入侵抑制剂筛选模型是获得药物的必要保证，目前关于HIV-1的细胞-细胞融合模型有很多，对于HTLV-1来说，因其受到关注的程度远小于HIV-1，已有的HTLV-1包膜糖蛋白Env介导的细胞-细胞融合模型均没有HIV-1的高效、方便和快捷。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种HTLV-1Env介导的细胞-细胞融合模型、制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法，包括以下步骤：将质粒pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07中HIV-1Env中对应的gp145片段后面第一个氨基酸残基(G713，按照国际标准病毒株HXB2编码)突变成终止密码子，获得突变体；用HTLV-1Env全长片段替换所述突变体的HIV-1Env基因的gp145片段，获得重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1。突变为终止密码子后，突变体表达的蛋白为gp145，序列见SEQIDNO.1所示。之后，将突变体中表达gp145的片段去除，将表达HTLV-1Env的片段与通过反向PCR去除gp145片段的线性化载体连接，替换HIV-1Env基因的gp145部分。进一步地，利用滚环PCR技术将所述G713氨基酸残基突变成终止密码子，所述滚环PCR技术涉及的点突变引物序列见SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。进一步地，利用反向PCR技术获得去除gp145片段的线性化载体，所述反向PCR技术涉及的引物序列见SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。进一步地，滚环PCR法点突变反应体系：滚环PCR法点突变反应条件：进一步地，所述HTLV-1Env片段序列见SEQIDNO.4所示。进一步地，获得重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1后转化至Top10感受态细胞中。一种按照上述的重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法构建的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1。如上述的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1在HTLV-1Env介导的细胞-细胞融合体系中的应用。如上述的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1在针对HTLV-1病毒的进入抑制剂筛选和/或验证方面的应用。一种HTLV-1Env介导的细胞-细胞融合体系，包括：效应细胞COS-1，权利要求6所述的质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1以及靶细胞TZM-bl。如上述的HTLV-1Env介导的细胞-细胞融合体系在针对HTLV-1病毒的进入抑制剂筛选和/或验证方面的应用。本专利技术将已经广泛应用成熟的HIV-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组HTLV-1 Env表达质粒pSRHS-Tat-Env

【技术特征摘要】
1.一种重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将质粒pSRHS-Tat-EnvHIV-1CRF07中HIV-1Env中对应的gp145片段后面第一个氨基酸残基突变成终止密码子，获得突变体；用HTLV-1Env全长片段替换所述突变体的HIV-1Env基因的gp145片段，获得重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1。


2.根据权利要求1所述的一种重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法，其特征在于：利用滚环PCR技术将所述氨基酸残基突变成终止密码子，所述滚环PCR技术涉及的点突变引物序列见SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求2所述的一种重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法，其特征在于：滚环PCR法点突变反应体系：



滚环PCR法点突变反应条件：





4.根据权利要求1所述的一种重组HTLV-1Env表达质粒pSRHS-Tat-EnvHTLV-1的构建方法，其特征在于：所述HTLV...

【专利技术属性】
技术研发人员：段良伟，王辉，郑倩倩，张赟，牛玉娜，张阳，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41