一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用，涉及医学工程技术领域。在目标动物的视网膜双极细胞中敲除Yap1基因即沉默其表达，可以使得目标动物表现出视网膜双极细胞病变性疾病相关的特征，例如双极细胞死亡，主要表现为双极细胞受损、变性，视网膜内核层逐渐变薄，视网膜外核层及其他相关细胞层出现相应病理改变。因此，敲除Yap1基因的目标动物可以作为视网膜双极细胞病变模型，该模型可以用于研究视网膜双极细胞病变类疾病的发病过程、发病机制，为深入了解研究该类疾病提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及医学工程
，具体而言，涉及一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用。
技术介绍
视网膜双极细胞(Bipolarcell)是脊椎动物视网膜的谷氨酸中间神经元，接受光感受器细胞的信号输入，在整合后传递至无长突细胞和神经节细胞，双极细胞在视网膜信号传递的过程处于一个类似中转站的关键位置。现已发现在多种视网膜疾病的发生发展中均伴随双极细胞的病变。视网膜色素变性(Retinitispigmentosa,RP)是一种导致视力丧失的进行性、遗传性致盲眼底病，通常为视网膜光感受器异常所致，临床要表现为慢性进行性视野缺失，夜盲，色素性视网膜病变和视网膜电图异常，最终可导致失明。对RP相关的动物模型研究发现，在视网膜变性过程中，视网膜双极细胞会出现病变的现象。这种病变包括双极细胞在变性过程中失去树突以及胞体丢失现象。而双极细胞的这些病变也同时会影响到双极细胞的视觉传递功能，导致相关视网膜疾病的病情加重甚至失明。然而，对于双极细胞病变在相关视网膜疾病发生发展中的作用尚不明了，并且双极细胞病变所致疾病表型的具体分子机制尚不清楚，这为该类疾病的临床诊断和治疗带来极大阻碍，因此有必要对双极细胞病变的详细致病机制进行深入研究。目前，缺乏相应的双极细胞病变模型。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用以解决上述技术问题。本专利技术是这样实现的：一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法，其包括：敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。Yap1(Yes-associatedprotein1，MGI:103262)基因位于小鼠9号染色体7,931,999-8,004,596bp，全长7.26kb，该基因在小鼠中共有10个转录本。其中最长转录本cDNA全长4171bp，包含9个外显子。Yap1是Hippo信号通路(Hippopathway)的一个下游转录因子，参与发育、生长、修复和体内平衡。早期研究人员发现，在Hippo信号通路正常的情况下，YAP1处于非激活状态；当Hippo信号通路中的某些分子发生突变时，YAP1处于超激活状态。此时，超激活状态下的YAP1可以促进细胞增殖、转移、生存以及维持干细胞活性。由于YAP1的超激活可以促进肿瘤的发生与发展，因此，YAP1被定义为一个癌蛋白。Yap1基因作为该信号通路的转录调节因子，在多种癌症的发生和发展中发挥重要作用，参与癌细胞的增殖分化以及肿瘤组织的血管生成，并可能成为癌症治疗的潜在靶点。目前尚无针对Yap1蛋白在视网膜及视觉功能维持中作用的研究报道，其详细作用机制以及其在视网膜中的生物学功能还不甚明了。因此，深入研究Yap1对视网膜双极细胞病变类疾病的治疗及病因探讨潜力巨大。但是目前对Yap1的研究还处于初期阶段，其在小鼠体内的具体作用机制尚不清楚，限制了其开发应用。专利技术人创造性的提供了一种高效稳定的Yap1基因敲除动物模型构建方法，为研究Yap1蛋白在视网膜及视觉功能中的作用提供了模型支持。专利技术人首次发现，在目标动物的视网膜双极细胞中敲除Yap1基因即沉默其表达，可以使得目标动物表现出视网膜双极细胞病变性疾病相关的特征，例如双极细胞死亡，主要表现为双极细胞受损、变性，视网膜内核层逐渐变薄，视网膜外核层及其他相关细胞层出现相应病理改变。因此，视网膜双极细胞中的Yap1基因被敲除的动物可以作为视网膜双极细胞病变疾病模型，并用于视网膜双极细胞病变疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因是指敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的外显子序列。敲除Yap1基因序列可以是敲除Yap1基因全长序列，敲除Yap1基因的外显子序列，也可以是敲除Yap1基因部分序列例如部分外显子序列，无论敲除那种类型(部分或全长)的序列，只要是能够在双极细胞中沉默Yap1基因的表达，使动物表现出视网膜双极细胞病变类疾病相应特征即落入本专利技术的保护范围。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的第1号到第9号外显子中的至少一个外显子序列。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的第1号到第2号外显子序列。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述构建方法包括：采用Cre-loxP敲除技术、CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术或转录激活因子样效应物核酸酶技术敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。在其他实施方式中，也可以是siRNA介导的基因沉默技术。此外，采用其他手段实现Yap1基因的敲除也属于本专利技术的保护范围。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述目标动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、猴、兔、牛、马、羊和猿中的任意一种。无论选用何种动物，只要是具有Yap1基因的动物，均可作为本专利技术所述构建方法中的目标动物，在其双极细胞中敲除Yap1基因，使其表现出视网膜双极细胞病变类疾病特征，作为视网膜双极细胞病变疾病模型，用于视网膜双极细胞病变类疾病研究领域中，均属于本专利技术的保护范围。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述构建方法是采用Cre-loxP敲除技术敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因，目标动物为小鼠，其包括：将条件性敲除Yap1基因的首建小鼠与野生型鼠交配繁殖，获得条件性敲除Yap1基因的杂合子小鼠，然后将条件性敲除Yap1基因的杂合子小鼠进行相互交配，得到Yap1基因条件性敲除纯合子小鼠，将纯合子小鼠与Chx10-Cre基因动物交配，得到视网膜双极细胞Yap1条件性敲除基因小鼠。条件性敲除Yap1基因的首建小鼠(Yap1cko小鼠，027929)购自美国杰克森实验室，Chx10-Cre转基因小鼠(MGI:5302217)购自美国杰克森实验室(Jacksonlaboratory)。此转基因小鼠表达视网膜双极细胞(Bipolarcell)特异蛋白启动子驱动的经过特殊改造的Cre基因。将纯合子小鼠与Chx10-Cre基因动物交配得到视网膜双极细胞Yap1条件性敲除基因小鼠。改造的Cre蛋白可以进入双极细胞的细胞核，识别基因组上LoxP位点，实现Yap1基因的条件性敲除。Chx10为双极细胞特异表达的基因，可以介导Cre在该细胞特异表达。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述条件性敲除Yap1基因的首建小鼠的Yap1基因带有loxP位点；优选的，条件性敲除Yap1基因的首建小鼠购自美国杰克森实验室，No：032192。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述将条件性敲除Yap1基因的首建小鼠与野生型鼠交配繁殖后，进行基因型鉴定，筛选获得条件性敲除Yap1基因的杂合子小鼠。由任一项的视网膜双极细胞病变模型的构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法，其特征在于，其包括：敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法，其特征在于，其包括：敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因是指敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的外显子序列。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的第1号到第9号外显子中的至少一个外显子序列。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的第1号到第2号外显子序列。


5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：采用Cre-loxP敲除技术、CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术或转录激活因子样效应物核酸酶技术敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。


6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述目标动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、猴、兔、牛、马、羊和猿中的任意一种。


7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：周波，朱献军，杨业明，王璐瑶，李潇，田万里，
申请(专利权)人：四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：四川;51