一种约氏乳杆菌及其制备的腺苷七肽、制备方法技术

本发明专利技术涉及一种约氏乳杆菌及其生产的腺苷七肽，腺苷七肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，在体外可降低70%以上的LPS活性，体内可通过抑制炎症因子产生，减少LPS攻毒小鼠的炎症反应，且无毒副作用，可与一种或多种辅料组合，用于制备饲料添加剂或药物组合物。本发明专利技术还提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，采用上述菌株在特制发酵培养基中发酵培养，通过超滤，等电点析出，离心等步骤可获得20~30kg/天产量的高纯度（90%）腺苷七肽，工艺简单、生产效率高、成本低，可实现规模化生产制备。

【技术实现步骤摘要】
一种约氏乳杆菌及其制备的腺苷七肽、制备方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种约氏乳杆菌、能制备钝化细菌脂多糖活性的腺苷七肽、还涉及其制备方法。技术背景脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的主要组成成分。脂多糖又称内毒素，当细胞死亡后，脂多糖被释放出来，在体内可以通过细胞信号转导系统激活内皮细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞等，使其合成和释放多种细胞因子和炎性介质等细胞刺激因子，进而激发机体积极防御，引起一系列炎性反应。LPS作为一种典型的细胞膜上的模式识别受体(MAMP)，是诱导动物肠黏膜损伤的应激源之一，其不仅可损伤肠道，还会引发细菌移位，损伤的胃肠道屏障会造成肠道紧密连接蛋白异常表达，使得内毒素、病原体等得以穿过肠壁。LPS能诱导活化细胞表面Toll样受体4(TLR4)激发下游的NF-κB信号通路，并合成释放细胞炎性因子(白介素IL-1β、IL-8和肿瘤坏死因子TNF-α等的表达)，继而加重肠道的损伤(王梦竹，脂多糖诱导的肠屏障蛋白及其信号通路研究进展，动物营养学报，2020)。很小剂量的LPS即可产生极其广泛的生物及病理作用，严重威胁人类健康(刘霏，内毒素脂多糖对药物转运体的影响研究进展，解放军药学学报，2015)。研究表明，某些蛋白和多肽可与LPS中和，从而缓减炎症，预防由革兰氏阴性杆菌引起的败血症(专利CN107200783A；石芳，生命的化学，2004，24(4)：312-314)。但目前作为能够降低LPS活性的多肽大部分来源于动物本身，如专利CN107200783A中能够结合LPS减低活性的为15个氨基酸残基组成的血浆高分子量激肽原，其实际生产过程需要从血浆中进行提取，生产工艺和环境要求苛刻，成本较高，无法在动物生产中应用。特定乳杆菌能够在LPS诱导的肠道炎症中发挥免疫调节作用，抑制细胞炎症信号通路的激活，降低炎症因子的表达，乳杆菌的抗炎作用可能通过其产生的代谢产物，如酸性代谢产物、胞外多糖、生物活性肽等发挥效应。但是，目前未见可生产、分泌能够降低LPS活性的纯化单体(肽)的乳杆菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能产生腺苷七肽的约氏乳杆菌，通过微生物发酵制备的腺苷七肽，无毒副作用，具有降低LPS活性的功效。本专利技术的目的是通过以下措施实现的：一种约氏乳杆菌，分类命名为约氏乳杆菌Lactobacillusjohnsonii，2020年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国北京，保藏号为CGMCCNO.19858。上述约氏乳杆菌，能制备高纯度(90％以上)的腺苷七肽，且能够实现高产。本专利技术的另一目的是提供一种腺苷七肽，其氨基酸序列为：MATGNAD(SEQIDNO:1)。上述腺苷七肽在体外可降低70％以上的细菌LPS活性，体内可减少LPS攻毒小鼠的炎症反应。一种饲料，包含上述腺苷七肽。一种药物组合物，包含上述腺苷七肽及一种或多种辅料。上述辅料包括填充剂、赋形剂、粘合剂、增溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、软膏剂、矫味剂、矫嗅剂、崩解剂、防腐剂。本专利技术还提供了一种发酵培养基，用于上述约氏乳杆菌的发酵培养，该培养基为蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、醋酸钠、硫酸镁的组合物，其中蛋白胨为1％，酵母浸出粉为0.5％，葡萄糖为2％；醋酸钠为0.5％；硫酸镁为0.05％，以重量百分比计，培养基pH为6.0～7.0。本专利技术还提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将上述约氏乳杆菌接种于上述发酵培养基，静置培养14～16小时，再按照10％体积转接于发酵培养基培养12～14小时，培养温度为35～37℃；步骤2：发酵液通过碟式离心机和陶瓷膜(孔径200nm)除杂，获得清液；步骤3：清液先后通过陶瓷超滤膜(2000Da)及陶瓷超滤膜(500Da)，收集浓液；步骤4：浓液通过调节等电点，离心获得沉淀物；步骤5：沉淀物按照1:5溶于去离子水(pH＝7.0～7.5)中，重复调节等电点及离心获得沉淀物；步骤6：沉淀物通过冷冻干燥(-80℃～-55℃，真空度<10Pa)，获得腺苷七肽纯品。上述制备方法中，等电点为PH＝6.3。有益效果：1.腺苷七肽(又名杆菌七肽、microcinC7肽)是由肠杆菌属、乳杆菌属等微生物分泌的一种细菌素类抗菌肽，其是由7个氨基酸残基组成的寡肽，C端通过N-酰磷酰胺键与5'-磷酸腺苷(AMP)所中和形成小分子量抗菌肽，具有一定的抗菌能力。腺苷七肽N端的蛋氨酸(Met)残基为其保守序列，不同微生物分泌的腺苷七肽的氨基酸残基略有所差异(OlgaBantysh，mBio，2014，5(3)：e01059-14)。本专利技术通过微生物发酵方法，从约氏乳杆菌的代谢产物中分离获得的腺苷七肽，安全性高，对细胞或生物体均无毒副作用，具有抗菌抗炎多重功效，可作为新型饲料添加剂、兽药或药物组合物成分等。2.本专利技术提供了一种制备上述腺苷七肽的约氏乳杆菌，采用微生物发酵即可大量获得高纯度的腺苷七肽，成本低、质量高、无毒害。3.本专利技术提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，采用上述菌株在特制发酵培养基中发酵培养，通过超滤，等电点析出，离心等步骤可获得20～30kg/天产量的高纯度(90％以上)腺苷七肽，生产工艺简单、生产效率高、成本低，可实现规模化生产制备。附图说明：图1是样品串联质谱序列匹配结果图2是腺苷七肽的结构式图3是不同浓度腺苷七肽与30μg/mLLPS混合30min后的各组LPS含量图4是各实验组中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10的表达水平图5是各实验组中NF-κB(P65)和iNOS的表达水平具体实施方案下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本专利技术进行进一步的说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。一、腺苷七肽的制备和回收1将约氏乳杆菌(CGMCCNO.19858)接种于MRS肉汤培养基，静置培养14～16小时，培养温度为35～37℃；2.将培养好的约氏乳杆菌按照10％体积转接于发酵培养基，每1000ml培养基成分为：蛋白胨10g；酵母浸出粉5g；葡萄糖20g；醋酸钠5g；硫酸镁0.5g，调节pH＝6.0～7.0(通过氢氧化钠进行调节)，溶氧≤10％(通过搅拌速度进行调节)，培养12～14小时，培养温度为35～37℃；与常规MRS与改良MRS培养基比较，上述发酵培养基能显著提高腺苷七肽的产量和纯度(表1)；3.发酵液通过碟式离心机和陶瓷膜(孔径为200nm)除杂，获得清液；4.将1.3步所获得清液先通过陶瓷超滤膜(2000Da)收集清液；5.将1.4所获得清液再通过陶瓷超滤膜(500Da)后收集浓液，即截留得到500～1500Da分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种约氏乳杆菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNO.19858。/n

【技术特征摘要】
1.一种约氏乳杆菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNO.19858。


2.如权利要求1所述的约氏乳杆菌，其特征在于：能制备腺苷七肽。


3.一种腺苷七肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


4.如权利要求3所述的腺苷七肽，其特征在于：可钝化70%以上的细菌脂多糖活性。


5.一种兽用饲料，其特征在于：包含据权利要求3所述的腺苷七肽。


6.一种药物组合物，其特征在于：包含据权利要求3所述的腺苷七肽和一种或多种辅料。


7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述辅料包括填充剂、赋形剂、粘合剂、增溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、软膏剂、矫味剂、矫嗅剂、崩解剂、防腐剂。


8.一种发酵培养基，用于培养权利要求1-2所述约氏乳杆菌的发酵培养，其特征在于为蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、醋酸钠、硫酸镁的组合物，其中蛋白胨...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江，杨贤斌，孟凡杰，杜飞，
申请(专利权)人：安杰利重庆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50