白细胞介素－２ ＩＬ－２及其基因在戒毒应用中的测试方法，其特征在于该方法包括下列步骤： （１）真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＬ－２的构建 人ＩＬ－２基因经ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ酶切得到有ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ接头的全长含信号肽的人ＩＬ－２ ｃＤＮＡ ４６２ｂｐ克隆入经相同酶切的ｐｃＤＮＡ３载体Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＩＬ－２基因在ＣＭＶ启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化，通过测定２６０ｎｍ的光吸收来确定质粒浓度，注射时质粒稀释于含５％葡萄糖的磷酸缓冲液中； （２）重组腺病毒Ａｄ５－ＩＬ－２的构建 人ＩＬ－２基因经ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ酶切得到有ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ接头的全长含信号肽的人ＩＬ－２ ｃＤＮＡ ４６２ｂｐ克隆入经相同酶切的ｐＣＡ１３载体Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，得到ｐＣＡ１３－ＩＬ－２，此时ＩＬ－２基因在ＣＭＶ启动子的控制下表达，ｐＣＡ１３－ＩＬ－２与腺病毒基因组质粒ｐＢＨＧ１０ Ｍｉｃｒｏｂｉｘ共转染２９３细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒，扩增纯化腺病毒，注射时病毒稀释于含５％蔗糖的ＰＢＳ中； （３）吗啡依赖小鼠模型的建立 以剂量递增法形成吗啡依赖小鼠模型，此组小鼠为吗啡依赖组，吗啡依赖小鼠腹腔注射纳洛酮４ｍｇ．ｋｇ↑［－１］可激发戒断症状，此组小鼠为吗啡戒断组； （４）吗啡依赖大鼠模型的建立 以剂量递增法形成吗啡依赖大鼠模型，此组大鼠为吗啡依赖组，吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮４ｍｇ．ｋｇ↑［－１］可激发戒断症状，此组大鼠为吗啡戒断组； （５）ＩＬ－２蛋白及ｐｃＤＮＡ３质粒介导ＩＬ－２基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立 用剂量递增法建立的吗啡成瘾小鼠模型，在末次给吗啡３小时后，将成瘾的小鼠随机分为８组，每组１０只，蛋白治疗组：经第５与第６腰椎之间，蛛网膜下腔，分别注射５×１０↑［３］，１×１０↑［４］，２×１０↑［４］，４×１０↑［４］，８×１０↑［４］ＩＵ ＩＬ－２蛋白，对照组为含５％葡萄糖的０．０１Ｍ磷酸缓冲液，ＩＬ－２基因治疗组：８μｇ ｐｃＤＮＡ３／８μｇ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，对照组，提前２４小时注射，８μｇ ｐｃＤＮＡ３－ＩＬ－２／８μｇ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，基因治疗组，提前２４小时注射，注射总体积为１０μｌ，注射后５分钟，各组小鼠腹腔注射纳洛酮４ｍｇ．ｋｇ↑［－１］激发戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、１５分钟内小鼠出现的跳跃次数及３０分钟内小鼠的体重变化； （６）ＩＬ－２蛋白抑制大鼠吗啡戒断症状测试方法的建立 用剂量递增法建立的吗啡成瘾大鼠模型，在末次给吗啡３小时后，将成瘾的大鼠随机分为４组，每组５－１１只，经第５与第６腰椎之间插入导管鞘内，蛛网膜下腔，分别注射２×１０↑［４］，４×１０↑［４］，１．４×１０↑［５］ＩＵ ＩＬ－２蛋白，对照组为含５％葡萄糖的ＰＢ，注射总体积为３０μｌ，注射后５分钟，各组大鼠腹腔注射纳洛酮４ｍｇ．ｋｇ↑［－１］激发戒断症状，观察大鼠的各种戒断症状，如湿狗样抖动、异常姿势、激惹、咬牙、腹泻、流涎、体重减少，并计算戒断症状总评分值； （７）腺病毒载体介导ＩＬ－２基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立 大鼠经第５与第６腰椎之间插入导管鞘内，蛛网膜下腔，分别注射含５％蔗糖的ＰＢＳ，１×１０↑［７］ｐｆｕ腺病毒５型Ａｄ５，１×１０↑［７］ｐｆｕＡｄ５－ＩＬ－２。注射总体积为１０μｌ。注射后一周测定腹腔注射纳洛酮４ｍｇ．ｋｇ↑［－１］激发的戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、１５分钟内小鼠出现的跳跃次数及３０分钟内小鼠的体重变化； （８）成瘾性试验 ａ．小鼠竖尾试验：小鼠随机分为六组，每组１０只，分别腹腔注射吗啡２０ｍｇ．ｋｇ↑［－１］阳性对照，腹腔注射含５％葡萄糖的ＰＢ阴性对照，腹腔注射ＩＬ－２蛋白１×１０↑［５］ＩＵ或１×１０↑［６］ＩＵ，及蛛网膜下腔注射ＩＬ－２蛋白１×１０↑［４］ＩＵ或１×１０↑［５］ＩＵ，观察给药后２小时内小鼠有无出现Ｓ形竖尾反应； ｂ．小鼠跳跃反应试验：小鼠随机分为三组，每组１０只，分别皮下注射含５％葡萄糖的ＰＢ阴性对照组或吗啡阳性对照组，腹腔注射ＩＬ－２蛋白，第一天注射５次，９：００、１０：００、１１：００、１３：００、１５：００，第二天注射２次９：００、１１：００，吗啡组小鼠起始剂量为２．５ｍｇ．ｋｇ↑［－１］，此后按５，１０，２０，３０，４０，５０ｍｇ．ｋｇ↑［－１］剂量递增；ＩＬ－２蛋白组剂量为１×１０↑［４］，２×１０↑［４］，４×１０↑［４］，８×１０↑［４］，１．６×１０↑［５］，３．２×１０↑［５］ａｎｄ６．４×１０↑［５］ＩＵ，于最后一次给药后２小时，腹腔注射纳洛酮１０ｍｇ．ｋｇ↑［－１］，观察１０分钟内小鼠跳跃反应次数； （９）统计方法 采用单因素方差分析。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘新恒，顾锦法，王晋慧，姚明忠，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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