用妊娠相关蛋白-A检测孕早期唐氏综合征的试剂盒制造技术

一种用于诊断孕早期唐氏综合征的妊娠相关蛋白－Ａ酶联免疫检测试剂盒，其由妊娠相关蛋白－Ａ标准品，多克隆抗体包被板，辣根过氧化物酶标记的妊娠相关蛋白－Ａ单克隆抗体，质控品和辅助试剂组成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学和生物学检测领域，具体而言，本专利技术涉及一种用妊娠相关蛋白-A(即Pregnancy-Associated Plasma Protein-A简称PAPP-A)检测孕早期唐氏综合征的试剂盒，这种试剂盒可以用于唐氏综合征诊断，尤其可用于孕早期(9-13周)发生唐氏综合征的危险性评估，本专利技术还涉及该试剂盒的制作方法和测定方法。唐氏综合征(Down’s Syndrome)又称先天愚型，是人类最常见的染色体疾病(21三体)，发病率为活产新生儿的1/600～1/800。唐氏综合征的临床特征为严重先天性智力低下，具有独特的面容(如宽眼距、低鼻梁)、及肢体短小等；并常伴有先天性心脏病、消化道畸形等症状。唐氏综合征缺乏有效的治疗手段。为了降低唐氏综合征的发病率和提高我国人口素质，目前只有加强产前诊断，尽早终止妊娠和防止患儿出生。进行绒毛活检或羊膜腔穿刺是一种目前采用的产前诊断方法，虽然准确度很高，但这是一种侵入性检查，有引起流产的危险(约有1％～2％的流产率)；而且实验方法繁琐、持续时间长，不适宜大规模普查。八十年代末人们开始用甲胎蛋白(AFP)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)等生物化学指标来筛查唐氏综合征。生化指标具有快速简便的优点，但是当唐氏综合征的发生时，血清中AFP和hCG浓度的改变一般在孕中期才比较明显，因此它们不适宜作为孕早期的唐氏综合征的筛查指标。本专利技术的目的正是为了克服上述已有检测指标的缺点和不足，本专利技术根据妊娠相关蛋白-A(即PAPP-A)在唐氏综合征刚发生时即呈现血清浓度明显降低的特点，将PAPP-A作为一种孕早期唐氏综合征的筛查指标，同时建立了PAPP-A的酶免定量检测试剂盒和测定方法，从而可以提高唐氏综合征的产前筛查率，有效地降低唐氏胎儿的出生率。因此，本专利技术的目的是提供了一种用妊娠相关蛋白-A(PAPP-A)检测孕早期唐氏综合征的试剂盒。本专利技术的上述目的是通过下列技术方案实施的一种妊娠相关蛋白-A(PAPP-A)的定量酶联免疫检测孕早期唐氏综合征的试剂盒，其特征在于它由PAPP-A标准品、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的PAPP-A单克隆抗体、质控品和辅助试剂组成。本专利技术试剂盒的制作方法包括标准品的制备、多克隆抗体包被板的制作、酶标单克隆抗体的制备、质控品的制备以及辅助试剂的配制。PAPP-A标准品可外购(比如，DSL公司)，也可自行制备。本专利技术试剂盒中的标准品是从足月产妇血清中提取制备的。一种制备步骤包括收集足月产妇静脉血，及时分离血清，低温贮存备用；累积的足月产妇血清经S-300凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、Heparin亲和层析三步层析进行PAPP-A的分离纯化，三步层析的顺序可以变换，本专利技术试剂盒使用的一种顺序依次为凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析；将获得的PAPP-A纯品按试剂盒的标准曲线最高点浓度(160ng/ml)进行稀释，然后进行分装、冷冻干燥，即获得PAPP-A标准品。本专利技术试剂盒中的多克隆抗体包被板可用PAPP-A蛋白水解酶纯品对兔或鼠免疫而获得的多克隆抗体包被酶标板而制作。本专利技术试剂盒中的多克隆抗体包被板是用经三次层析分离纯化得到的PAPP-A纯品对兔子免疫而获得的兔抗人多克隆抗体包被酶标板而制作的。酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、6×8可拆条板。本专利技术试剂盒采用一种进口酶标板(Costar公司产品)。一种多克隆抗体包被酶标板的制作步骤如下a)制备多克隆抗体(1)免疫兔子选用三月龄大耳白雄兔3只，用PAPP-A纯品按常规进行免疫。基础免疫抗原用量为每只兔子500μg PAPP-A，加强免疫抗原用量250μg/只，共两次。一个月后开始从耳缘静脉取血，每周一次，分离血清贮存于4℃。(2)血清筛选用PAPP-A纯品按2μg/孔包被酶标板，及时跟踪监测每只免疫雄兔血清中的PAPP-A抗体滴度上升状况。将筛选出的雄兔进行颈动脉放血，分离血清，加0.01％硫柳汞于4℃保存。(3)抗血清纯化高滴度的抗血清经饱和硫酸铵沉淀等步骤纯化后即获得PAPP-A多克隆抗体。b)包被将上述多克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100ul，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得多克隆抗体包被酶标板。本专利技术试剂盒中的酶标单克隆抗体是用PAPP-A纯品免疫小鼠、获取脾细胞、经过与骨髓瘤细胞融合等步骤获得单克隆抗体，再将单克隆抗体用辣根过氧化物酶(HRP)标记而制备的。一种酶标单克隆抗体的制备步骤如下a)免疫小鼠获取脾细胞用PAPP-A纯品作为抗原免疫Balb/c小鼠，免疫程序结束后获取脾细胞，在二氧化碳孵育箱中按常规方法进行培养；b)细胞融合及阳细胞筛选将上述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，在甲基纤维素半固体培养基中进行选择性培养；筛选阳性融合细胞后进行克隆化培养，可获得强阳性单克隆杂交瘤细胞株；c)获取腹水和腹水纯化将上述杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，获得小鼠腹水；使用重组Protein G亲和层析预装柱纯化小鼠腹水即可获得PAPP-A单克隆抗体。d)HRP酶标采用改良过碘酸钠氧化法适量HRP酶溶于0.5ml乙酸缓冲液(pH5.6)，加入新鲜配置的适量NaIO4(0.06M)溶液，反应充分后加入0.5ml乙二醇(2.5％)；将5mg纯化好的PAPP-A单抗隆抗体溶液加入，经透析、硼氢化钠反应、饱和硫酸铵沉淀等步骤后，即获得HRP酶标PAPP-A单克隆抗体。e)纯化用重组Protein G亲和层析预装柱去除游离的HRP酶，获得克分子比接近0.4的HRP酶标PAPP-A单克隆抗体。本专利技术试剂盒中的质控品是用正常妇女血清稀释混合足月产妇血清、并按照本试剂盒的标准曲线范围要求而调配制备的。本专利技术试剂盒采用的一种质控品制备方法包括如下步骤a)收集足月产妇静脉血(经HIV、肝类病毒、AIDS、梅毒等测定均为阴性者)，经离心后收集血清于-20℃保存；b)将积累的各个血清混合，用ELISA方法测定PAPP-A含量，并按标准曲线要求，用正常妇女血清将两份混合产妇血清的浓度分别调至20±5ng/ml、85±15ng/ml范围；c)将步骤b)所获得的两份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成低、高值质控品。本专利技术试剂盒中的辅助试剂包括酶联反应的底物溶液，显色液，反应终止液和清洗缓冲液。一种配制辅助试剂的方法如下a)底物溶液磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；b)显色液四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；c)反应终止液2M硫酸d)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20X)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。本专利技术试剂盒的测定方法，其特征在于它依次按下述步骤进行a)抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μl已稀释好的不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品，37℃水浴保温60分钟；然后用清洗缓冲液重复洗板4次。b)酶联反应将HRP酶标单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温60分钟。重复洗板操作4次。c)显色反应每孔依次加入底物溶液、显色液各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，吴尔若，
申请(专利权)人：北京新科基业生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：