体细胞快速染色技术制造技术

体细胞快速染色技术属于细胞病理学领域，解决了传统的巴氏、Ｈ＆Ｅ染色技术对细胞蛋白质的破坏作用，克服了Ｇｉｅｍｓａ染色技术对细胞染色不清晰、染色时间长的弱点。体细胞快速染色试剂的主要技术特征是高色差、梯度ｐＨ值、着色快速。梯度ｐＨ值适合细胞酸性物质与碱性物质对染色试剂的要求，对细胞蛋白质不产生破坏作用；高色差性能提高了光学显微镜下细胞核、细胞浆中可见物质的分色性能。染色后的细胞核染色质结构、核仁的数目和形态、核仁内紫红色颗粒、滴虫的鞭毛与胞浆内颗粒、霉菌假菌丝内不规则染色质形态得以清晰显示，癌前病变细胞形态学鉴别结果与现代细胞遗传学研究结果相吻合（图１）。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
一.
体细胞快速染色技术应用于细胞病理学领域。二.
技术介绍
在细胞病理学领域中，Giemsa、巴氏及H&E染色技术等，为组织病理学、细胞病理学的发展作出了巨大贡献并沿用至今。但这些染色技术对细胞显示的结果，与现代细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学的研究结果在以下几个方面不相吻合(一)正常细胞核中核仁的数目和形态 在细胞形态学观察中，细胞核的特征历来是细胞学家判断细胞“良”与“恶”的重要标准，而核仁则是判断细胞“良”与“恶”的窗口。在细胞病理学领域中，国外大多偏爱巴氏染色技术，而国内在染色技术的选择上则多样化。在核仁数目和形态观察结果上，国内外至今不统一。有的学者认为核仁见于某些间期细胞的核内，呈球形，多为1～2个，也有3～5个的。有的学者认为核仁圆形或卵圆形结构，有1～8个核仁。还有的学者认为核仁的数目和大小依细胞种类及生理状态不同而有很大变化，一般为1～2个，也有多个的。在我国2000出版的具有权威性的《病理学技术》一书中，也认为正常细胞核内含有1～2个核仁，可见核仁数目范围观察结果的不一致性。现代生物学、细胞遗传学以及分子生物学研究结果表明，人类正常细胞有46条染色体，其中有10条染色体上含有核仁组织区(hucleolus organizerregion，NOR)。人类rRNA基因定位于5对近端着丝粒染色体上(13、14、15、21和22号染色体)。当10条含有NOR的染色体解螺旋进入间期后，NOR随机分配在球形细胞核内。普通光学显微镜下，仅看到了细胞的一半。在概率上，如果染色技术能清晰显示细胞核结构的话，人类应该观察到的能够分裂的正常细胞核仁的数目应该是5个。在考虑到人类进化过程中端着丝粒染色体随机联合的生物学特征，以及人体细胞类型(包括静止期细胞在内)的差异性，正常细胞核仁的数目的范围应该是0～5个。这样看来，有关核仁的数目和形态，用Giemsa、巴氏、H&E染色技术对细胞显示的结果与现代科学研究结果是不完全吻合的。电镜研究的结果证明，核仁没有膜包围，是由转录产物的前体rRNA(precursor rRNA，pre RNA)相互缠绕的网状结构。NOR从中期进入间期，随染色质的随机分布而分布，其分布的方向性决定了间期核仁的形态不是千篇一律的圆形或卵圆型，而应该具备多态性。在国内外判断肿瘤细胞的若干著作中认为“如果核仁的直径增大达5μm，其数目超过3-4个，应当考虑是癌细胞”。这些观察结果及判断癌细胞的标准与现代科学研究的结论存在一些矛盾，给细胞“炎性病变”、“癌前病变”、“恶性病变”的判断与区别造成诸多不便。细胞病理学是前辈们心血堆集的产物，我们无意因申请专利去批驳细胞学家们的观察结果。但基于细胞是一个整体，细胞核遗传物质(DNA)的复制需RNA转录、以及细胞质中蛋白质合成与运输的客观规律，正常细胞核仁数目与形态是细胞形态鉴别基本参照标准。(二)细胞质的功能状态 根据现代细胞生物学，细胞核内的各种蛋白质(如组蛋白、DNA和RNA聚合酶、基因调节蛋白等)都是在胞质溶胶内合成，并通过核孔输入到细胞核。核内的蛋白质在细胞分裂时与胞质混合，分裂完成后再输入细胞核。然而，自Papanicolaou氏(1928)提出妇科宫颈阴道细胞学及有关“癌前核异质”(1943)以来，在我国有关癌前核异质细胞形态最明确的描述，见中国医学科学院肿瘤研究所和肿瘤医院细胞学室《临床肿瘤细胞学图谱》(1976)。该著作对宫颈鳞状细胞“癌前核异质”形态进行了这样的描述“核大，核染质不匀，核周有空泡”。1988年美国提出Bethesda系统将“反应性或癌前病变/恶性过程”定义为ASCUS(未明确意义的不典型鳞状细胞)。即ASCUS类型的细胞改变可以反映高度的良性病变或潜在的严重病变，这些病变又不能明确分类，而称之为“未明确意义”。美国细胞病理学家Kini认为“此种分类已经造成并继续造成在细胞学技术学家、病理学家和临床医师的很大混乱”。(请参阅SudhaR.Kini编著，张慧英主译《细胞病理学鉴别诊断彩色图谱—脱落和穿刺细胞病理学》.天津科技翻译出版公司出版，2000年第1版)。可见细胞病理学经过半个多世纪的研究和探索，尚未将癌前病变细胞形态鉴别出来。细胞病理学一直以细胞核的形态学特征作为鉴别细胞的标准，即便是近年，Kini在其著作中也强调“必须牢记，无论胞浆的特点表现的如何极端和怪异，都不能鉴别其良、恶性”。其原因在于目前国内外使用的传统染色技术(Giemsa、巴氏、H&E等)尚不能清晰显示细胞质的功能状态，而导致细胞质的功能状态可能被忽略了。根据细胞生物学、病理生物学、遗传学的研究结果，以及细胞突变形成癌的理论。细胞遗传物质损伤、重组前首先被破坏的是细胞质。按照一般规律DNA复制、RNA转录、细胞质中的细胞器(如粗面内质网)合成蛋白质。所以，细胞质的功能状态对于判断鳞状上皮细胞的癌前病变极为重要。这是因为，细胞突变(遗传物质损伤与重组)→选择优势→形成克隆→肉眼可见的肿瘤过程中，在形成克隆前将出现以下几种情况①如果突变细胞核周围的细胞质完全坏死，突变细胞不可能生长繁殖；②突变细胞核周围的细胞质因损伤坏死而形成的“核周亮晕”，是不被染色液着色的坏死区域，阻断了RNA的信息传递以及细胞质内蛋白质合成与运输途径。这种突变细胞也不能生长繁殖；③突变细胞核周围存在部分能合成蛋白质的细胞质。而这种部分能合成蛋白质的细胞质，是突变细胞生长繁殖的物质基础，在条件适宜时将在新遗传程序控制下进行修复，完成病理状态向一种新的生理状态转化，形成癌细胞克隆，进而可发展成肉眼可见的癌瘤组织。故巴氏(1943)提出的“癌前核异质”、中国医学科学院肿瘤研究所和肿瘤医院细胞学室(1976)描述的癌前核异质的细胞形态、美国1988年Bethesda系统ASCUS定义的“核周亮晕”细胞，是无核仁的，对提示细胞的癌前病变可能没有实际意义。由于Giemsa、巴氏、H&E染色技术不能完全清晰地显示细胞核染色质细微结构、核仁数目与形态结构、细胞质的功能状态，可能使细胞病理学观察形成了历史性误区，导致了细胞病理学观察的结果与现代细胞生物学、细胞遗传学以及分子生物学的研究结论不完全吻合。正如国际著名病学家Karl Lennert教授的名言“技术是病理学之母”，以及我国程天明院士指出的那样“病理学的理论和技术被视为一辆车的两个轮子，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决定病理学的发展”。另一方面，对于癌前病变细胞的鉴别，细胞质的功能状态决定了突变细胞的能量供应。因此，染色液能否清晰显示细胞质的坏死程度的界限就显得非常重要。造成Giemsa、巴氏及H&E染色技术在细胞病理学领域中，对细胞显示的结果与现代科学理论与研究结果不完全吻合的原因在于①Giemsa染色技术显示的细胞色差弱，且极易染成模糊的色团，使细胞的细微结构不易分辨；②巴氏染色技术对组织病理学的贡献极其巨大，该技术也被国内外广泛地用于细胞病理学领域，学术界一直认为“细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆着色艳丽。其缺点是试剂种类多、染色手续繁杂、时间长、不宜染厚涂片等”。巴氏染色技术对组织结构的透明性能是无可挑剔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组织细胞的高色差、梯度ｐＨ值、快速染色的配方，该配方（Ａ）液吸收波长５２１±５ｎｍ（说明书附图１／８中图２）、ｐＨ值４～５；（Ｂ）液吸收波长６５７±５ｎｍ（说明书附图２／８中图３），ｐＨ值６～７；其特征在于清晰而正确显示细胞核细微结构、核仁数目、核仁形态多样性以及核仁内的紫红色颗粒（说明书附图４／８、５／８中图８、９、１０、１１；８／８中图２１）、细胞质的功能状态（说明书附图５／８、６／８、７／８中图１３－１８）；清晰显示霉菌假菌丝内不规则的染色质形态（说明书附图７／８中图１９）；清晰显示阴道滴虫鞭毛、核及胞浆内颗粒状结构（说明书附图８／８中图２０）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：竹琴，殷路，
申请(专利权)人：竹琴，殷路，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]