猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法技术

猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术针对不同基因型PCV的ORF1和ORF2基因设计能鉴别PCV1,PCV2,PCV3和PCV4的特异性引物和探针序列，用不同荧光素标记的PCV1‑4毒株的探针，每条探针可用任意一种荧光素标记，且四种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，将分别用于检测PCV1‑4毒株的上述引物和探针，或者用于鉴别PCV1‑4毒株的上述引物和探针，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PCV1到4型毒株的鉴别检测。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法
本专利技术属于生物
，涉及四重实时荧光PCR检测，具体涉及猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属。PCV是一种目前已知最小的环状单股DNA病毒，病毒颗粒直径约17nm，无囊膜，呈二十面体对称。目前，PCV可以分为四种基因型(PCV1,PCV2,PCV3,PCV4)。1974年，PCV1首先从污染的猪肾细胞系PK-15中发现。目前认为PCV1对猪无致病性。1998年，首次报道PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征和猪皮炎肾病综合征等密切相关。2015年，PCV3在猪皮炎肾病综合征和流产猪群中首次发现。2019年，PCV4首次在我国湖南发病猪群中发现。PCV四种基因型之间核苷酸同源性较低，为35％～75％。由于PCV不同基因型毒株的致病性、抗原性和基因组均具有显著差异，因此，对不同亚型的PCV进行快速鉴别诊断对临床上采取针对性的有效防控措施具有重要意义。目前检测PCV的经典方法主要包括血清学检测和PCR检测等。但是这些方法比较费时费力、敏感性低且容易出现假阴性。目前虽然已经建立了针对不同PCV亚型的实时荧光PCR检测方法，但是均不能对PCV1到PCV4四种基因型病毒同时进行鉴别检测。因此，本专利技术旨在建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可重复性好的PCV1到PCV4四重鉴别检测方法。
技术实现思路
本专利技术为弥补PCV四种基因型毒株快速鉴别检测方法的不足，提供一种猪圆环病毒1到4型(PCV1-4)四重实时荧光PCR鉴别检测方法。本专利技术检测方法只需要一次检测便能判定样品是否含有PCV1,PCV2,PCV3,PCV4,或者两种以上基因型毒株共同感染。本专利技术方法快速、便捷、特异性强、敏感性高、可重复性好，可以进行大批量样品PCV感染情况的快速鉴别检测分析，有很好的应用前景。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。本专利技术一个方面涉及四种引物对(包含八条引物序列)，其中：PCV1引物对包含PCV1-F2020:AACCCCATAAGAGGTGGGTGTT和PCV1-R2020：TTCTACCCTCTTCCAAACCTTCCT的核苷酸序列；PCV2引物对包含PCV2-F2020:CTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGT和PCV2-R2020：ACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGA的核苷酸序列；PCV3引物对包含PCV3-F2020:CATAAATGCTCCAAAGCAGTGCT和PCV3-R2020：TCACCCAGGACAAAGCCTCTT的核苷酸序列；PCV4引物对包含PCV4-F2020:ATTATTAAACAGACTTTATTTGTGTCATCACTT和PCV4-R2020：ACAGGGATAATGCGTAGTGATCACT的核苷酸序列。本专利技术的另一方面涉及四条探针，包含：PCV1的探针PCV1-P2020：TCCGAGGAGGAGAAAAACAAAATACGGGA的核苷酸序列；PCV2的探针PCV2-P2020：TTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGT的核苷酸序列；PCV3的探针PCV3-P2020：ATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGGTCT的核苷酸序列；PCV4的探针PCV4-P2020：ATACTACACTTGATCTTAGCCAAAAGGCTCGTTGA的核苷酸序列。本专利技术还涉及一种用于同时检测PCV1到4型(PCV1-4)毒株的寡核苷酸引物对和探针的组合物，包括上述的引物对以及探针。此外，还可将上述组合物制备成试剂盒。进一步的，本专利技术还涉及试剂盒在同时检测PCV1到4型(PCV1-4)毒株中的应用，其中的探针用任意一种荧光素标记，且四种探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5等荧光素。一种利用上述组合物同时鉴别检测PCV1到4型(PCV1-4)的四重实时荧光PCR方法，包括：(1)针对不同基因型PCV的ORF1和ORF2基因设计的能鉴别PCV1,PCV2,PCV3和PCV4的特异性引物和探针序列。(2)用不同荧光素标记的PCV1-4毒株的探针，每条探针可用任意一种荧光素标记，且四种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5等荧光素。(3)将分别用于检测PCV1-4毒株的上述引物和探针，或者用于鉴别PCV1-4毒株的上述引物和探针，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。本专利技术的显著特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PCV1到4型(PCV1-4)毒株的鉴别检测，可以确定样本是哪种PCV基因型毒株的感染，或者是两种以上PCV不同基因型毒株的共同感染。具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率等优点。附图说明图1为PCV1到4型(PCV1-4)毒株四重实时荧光PCR检测方法特异性扩增曲线图；图中PCV1,PCV2,PCV3,PCV4代表性毒株均能得到特异性扩增曲线，而其他病毒(PPV,PRV,PRRSV,PEDV和CSFV)均无特异性扩增；图2为PCV1到4型(PCV1-4)毒株四重实时荧光PCR检测方法中PCV1-4毒株的敏感性扩增曲线图；图中A:曲线分别代表PCV1在浓度为1x108～1x101拷贝数时的扩增结果；图B中曲线分别代表PCV2在浓度为1x108～1x101拷贝数时的扩增结果；图中C曲线分别代表PCV3在浓度为1x108～1x101拷贝数时的扩增结果；图中D曲线分别代表PCV4在浓度为1x108～1x101拷贝数时的扩增结果。具体实施方式下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。本专利技术所用到的生物实际的来源和规格如下：鉴于PCV3和PCV4目前尚无法体外分离，本专利技术实施例中所用到病原均使用测序验证过的临床阳性样品。猪圆环病毒1型(PCV1)，2型(PCV2)，3型(PCV3)，4型(PCV4)，猪细小病毒(PPV)，猪伪狂犬病毒(PRV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)等阳性样品均由本实验室保存。在本专利技术实施例中，使用的其他试剂：RNaseFreeH2O购自Solarbio公司；HiPureTissueDNAMiniKit购自Mag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法，其特征是，包括以下步骤：/n1）针对不同基因型PCV的ORF1和ORF2基因设计能鉴别PCV1,PCV2,PCV3和PCV4的特异性引物和探针序列；/n2）用不同荧光素标记的PCV1-4毒株的探针，每条探针可用任意一种荧光素标记，且四种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5荧光素；/n3）将分别用于检测PCV1-4毒株的上述引物和探针，或者用于鉴别PCV1-4毒株的上述引物和探针，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。/n

【技术特征摘要】
1.猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法，其特征是，包括以下步骤：
1）针对不同基因型PCV的ORF1和ORF2基因设计能鉴别PCV1,PCV2,PCV3和PCV4的特异性引物和探针序列；
2）用不同荧光素标记的PCV1-4毒株的探针，每条探针可用任意一种荧光素标记，且四种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5荧光素；
3）将分别用于检测PCV1-4毒株的上述引物和探针，或者用于鉴别PCV1-4毒株的上述引物和探针，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。


2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法，其特征是，所述引物为四种引物对，包含八条引物序列，其中，
PCV1引物对包含PCV1-F2020:AACCCCATAAGAGGTGGGTGTT和PCV1-R2020：TTCTACCCTCTTCCAAACCTTCCT的核苷酸序列；
PCV2引物对包含PCV2-F2020:CTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGT和PCV2-R2020：ACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGA的核苷酸序列；
PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈南华，肖延昭，朱建中，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32