二氯罗丹明染料的合成方法及其应用技术

本发明专利技术公开了二氯罗丹明染料的合成方法及其应用，以及制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。该方法包括：将式(I‑a)所示化合物与式(I‑b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物。该方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料。

【技术实现步骤摘要】
二氯罗丹明染料的合成方法及其应用
本专利技术涉及有机合成领域，具体地，本专利技术涉及二氯罗丹明染料的合成方法及其应用。
技术介绍
罗丹明是一类典型的氧杂蒽类化合物。罗丹明类染料是指以罗丹明为母体，经过官能团修饰得到的一系列染料衍生物。该类染料具有光稳定性好、对pH不敏感、荧光量子产率高，较宽的波长范围以及化学合成和修饰简单等优点，是一种重要的荧光小分子染料探针，广泛应用于生物样品的染色与荧光标记中，也广泛的应用于分析化学领域。二氯罗丹明化合物与典型的罗丹明染料类似，它作为一种能量转移荧光染料已经在多篇文献和专利中有所描述，主要应用于分子生物学、细胞生物学和分子遗传学。例如，用来标记脱氧核苷酸、二脱氧核苷酸、多核苷酸，测定DNA序列及碎片分析，是一类用于多重检测的荧光染料；还有一些作为荧光标记可以附着在用荧光磷酸化试剂合成的新生或完整的寡核苷酸链上制作成商业化试剂。以上的所有应用都基于可以得到高纯度、单一的目标罗丹明染料，但现有文献和专利都没有其具体的合成及纯化方法。ABI公司在Sanger法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒，即BigDyeTM试剂，接着再结合毛细管电泳，产生了ABI3730和ABI3500等非常成功的测试仪器，主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％。基于Sanger原理的毛细管电泳法的ABI3730，ABI3500以及其必须的BigDye测序试剂，仍是业内公认的超高精度测序的黄金标准。BigDyeTM试剂包括AcceptorDye、连接链(Linker)、ddNTP三部分组成，以ddTTP-Linker-dTMRA为例，该路线中AcceptorDye(二氯罗丹明染料)是dTMRA，简要合成方法是3-二甲氨基苯酚和3,6-二氯-1,2,4-偏苯甲酸酐在多聚磷酸里加热到180-190摄氏度，经过酸洗，水洗得到的产物性状差，纯度低，并不利于其后期的反应和应用。另外还有一些报道，罗丹明类荧光染料典型制备方法是通过合适的氨基酚与各种苯甲酸、邻苯二甲酸、苯酐、磺基苯甲酸及其酸酐反应，用浓硫酸、无水氯化锌及其他Lewis酸作催化剂缩合，由于分子结构中含有共轭π键和较活泼的助色基团，通过引入不同的官能团对罗丹明的结构进行修饰，可以设计合成出许多罗丹明类衍生物。但受限其产率不高，不容易得到高纯度、单一的目标罗丹明染料而不适用于大量的合成，使其应用也收到很大局限。因此，开发一种简单、高收率的合成二氯罗丹明类化合物的方法迫在眉睫。
技术实现思路
现有技术中，以BigDyeTM试剂目前的合成方法为例，AcceptorDye(二氯罗丹明染料)作为一种关键荧光试剂，在文献报道中的反应过程较复杂、产率极低、分离纯化难度较大且条件苛刻，得到的不是干净且单一的产物，不能够用于大量的合成。基于上述问题的发现，专利技术人提出了一种简单的、快速的、高效的合成二氯罗丹明染料的方法以及纯化方法，该方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料，消除不必要的影响因素，如大大提高BigDyeTM试剂合成的成功率。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，其中，R1、R2各自独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C3-8环烷基、3-8个原子组成的杂环基，R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6卤代烷基，或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，或R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代。根据本专利技术实施例的方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料，消除了不必要的影响因素，例如大大提高后续BigDyeTM试剂合成的成功率。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包含二氯罗丹明染料标记的双脱氧核糖核苷酸，如BigDyeTM试剂，所述BigDyeTM试剂由二氯罗丹明染料、连接链、ddNTP组成，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的。需要说明的是，现有技术中BigDyeTM试剂包括：受体染料(AcceptorDye)、连接链(Linker)、双脱氧核苷酸类似物(ddNTP)组成，本申请的试剂盒是在现有技术的基础上，将其中的受体染料的合成方法替换成本申请的合成方法，连接链、双脱氧核苷酸类似物的合成以及其余后续测序中的应用同现有技术。根据本专利技术的实施例的试剂盒测序准确，精度高。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了另一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包含二氯罗丹明染料标记的dNTP，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的。在本专利技术的第四方面，本专利技术提供一种二氯罗丹明染料标记的多核苷酸。根据本专利技术的一些实施例，二氯罗丹明染料还可以标记更多种物质用于物质分析。在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种测序方法。根据本专利技术的实施例，包括：利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的；以及基于测序合成过程中所检测到的荧光信号，确定待测样本的核苷酸序列。需要说明的是，本专利技术利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记的方法、以及测序方法是现有技术中的一般方法，区别在于，本专利技术中的二氯罗丹明染料是根据本专利技术实施例的方法合成的。根据本专利技术实施例的方法测序准确度高。附图说明图1是根据本专利技术实施例的制备获得的dTMRA(I-1)与标准品LC谱图；图2是根据本专利技术实施例的制备获得的dTMRA(I-1)与标准品MS谱图；图3是根据本专利技术实施例的制备获得的dROX(II-1)与标准品LC谱图；图4是根据本专利技术实施例的制备获得的dROX(II-1)与标准品MS谱图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。本专利技术将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出，实施例都伴随有结构式和化学式的图解。本专利技术有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能像权本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法，其特征在于，包括：/n将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，/n

【技术特征摘要】
1.一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法，其特征在于，包括：
将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，



其中，R1、R2各自独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C3-8环烷基、3-8个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，R1、R2各自独立地为H、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基、C5-6环烷基、5-6个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基、C1-3卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-6烷氧基、C1-3烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-6个环原子形成的杂环基以及R2与R4连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基取代。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物的摩尔比为2:1；
任选地，所述傅克酰基化反应后，进一步包括纯化处理；
任选地，所述纯化处理是通过高效制备液相色谱处理进行的；
任选地，所述高效制备液相色谱的条件如下所示：
流动相：乙腈和0.1MTEAB，
流速：30ml/min，
色谱柱：250*30mmC18柱，
梯度洗脱；
任选地，所述纯化处理前进一步包括第一过滤处理，所述第一过滤处理是通过有机相滤膜进行的。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述傅克酰基化反应是通过如下方式进行的：
将第一式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物发生第一傅克酰基化反应以便获得式(III)所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张少桥，朱永豪，周远，王明，李汉东，章文蔚，
申请(专利权)人：湖北华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42