基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于免疫传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用。首先将氧化石墨烯分散液滴涂到经清洁后的传感器电极上，再将壳聚糖乙酸溶液滴涂到电极表面，经电化学还原将氧化石墨烯转化为石墨烯，利用石墨烯生物相容性及表面的羧基使钙卫蛋白抗体易于富集并固定在电极表面。上述电极经活化、固定钙卫蛋白抗体、封闭活性点位，最后通过抗原抗体的免疫反应将钙卫蛋白固定在电极上。由于石墨烯优良的导电性能电极在电化学探针铁氰化钾溶液中的峰电流明显增大，可显著提高该免疫传感器的灵敏度。石墨烯优异的生物相容性可有效提高电极表面钙卫蛋白抗体的修饰量，进而增大电极对钙卫蛋白浓度的检测范围。

【技术实现步骤摘要】
基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用
本专利技术属于免疫传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在消化系统肿瘤疾病中具有较高的发病率。随着环境污染与食品安全问题的日益严峻和人们生活节奏的加快，饮食结构发生不同程度的改变，加之人口老龄化的发展和身体机能的减弱，使得老年人成为结直肠癌的高发人群。近年来，该病的发病率呈现出明显增加的趋势，严重影响着公众身体的健康，早期发现、早期诊断、早期治疗对于延长患者生存时间、改善患者预后和降低死亡率具有非常重要的意义。钙卫蛋白是一种中性粒细胞与巨噬细胞胞质来源的含钙蛋白，可以在粪便中稳定存在的炎性标记物。研究显示在结直肠癌患者粪便中，钙卫蛋白的含量较正常值明显升高，因此检测粪便中的钙卫蛋白浓度可作为筛查早期大肠癌患者的重要手段之一。钙卫蛋白(Calprotectin,CP)是一种钙结合蛋白，属于S100蛋白家族，最早在1980年从中性粒细胞中分离而被发现。钙卫蛋白由两条S100A9重链和一条S100A8轻链非共价结合形成异二聚体，每条链可结合两个钙离子。钙卫蛋白是一种杂合性的钙结合蛋白，在钙离子存在的情况下具有抗蛋白酶活性，在肠腔和外界环境中长期保持稳定，不被各种酶和细菌破坏，是中性粒细胞和活化的巨噬细胞胞质中重要的蛋白质，可以作为急性炎性细胞活化的标志物。钙卫蛋白在粪便中非常稳定，可以在室温下保存7天而不会引起损失且不随温度变化而变化。通过检测钙卫蛋白浓度能够鉴别大肠癌和炎症性肠病(IBD)。研究表明钙卫蛋白对腺瘤的敏感性为55％，而粪便隐血实验(FOBT)对腺瘤的敏感性仅为10％。钙卫蛋白的检测对于早期发现腺瘤具有更高的价值，这是因为腺瘤的恶变期为5～7年，腺瘤是唯一可以在恶变前可以检查到的肿瘤，检测钙卫蛋白对肿瘤早期排查具有极其重要的意义。电化学生物传感器检测钙卫蛋白的方法同结肠镜检查相比，具有简便、经济、无创性等优点，一定程度上可以避免结肠镜检查给患者造成的痛苦，且弥补不能随时复查的不足。同粪便潜血检验相比较，粪便钙卫蛋白可以定量检测，能发现早期不出血病灶，而且结果不受全身情况、饮食成分、一般药物及营养支持治疗的影响。还可以用于对已经确诊的病例的病情监测，对评价药物疗效也具有重要指导意义。目前国内外研究结果均表明结直肠癌患者粪便中钙卫蛋白水平高于正常人。Poullis[1]等研究证明粪便钙卫蛋白与大肠癌的相关危险因素呈高度正相关。郭汉斌等[2]研究发现粪便钙卫蛋白浓度对大肠癌的检测有较高的敏感性，且不受肿瘤部位的影响。Tibble等[3]研究发现粪钙卫蛋白检测比粪便潜血试验灵敏度高。目前，临床常用的对于钙卫蛋白的检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)和胶体金等方法，但这些方法都有各自的特点及不足。ELISA法由于定量准确，广泛应用于医院检验，但该法存在检测步骤多、时间长和不便捷的缺点；胶体金法虽然方便、快捷，但只是一种定性方法，灵敏度较低。因此，临床检测上迫切需求建立一种快速、便捷、经济的钙卫蛋白定量检测方法。电化学免疫传感器测定法可以满足上述要求并且具有分析速度快、分析方法简便、灵敏度高等优点。近年来出现的新兴纳米碳材料石墨烯具有独特的结构和优异的性能，它具有非常高的机械强度、大的比表面积以及极强的电子传输能力，且成本低廉，可加工性好；石墨烯大的比表面积对钙卫蛋白抗体具有富集作用，而石墨烯的生物相容性使钙卫蛋白抗体易于在其表面吸附并保持其生物活性，利于后续的与钙卫蛋白发生免疫反应，实现对钙卫蛋白浓度的检测。综上所述，石墨烯的生物相容性保证其表面吸附的钙卫蛋白抗体保持生物活性；石墨烯的高导电性和高电子传导速率可以实现对电极吸附不同浓度的钙卫蛋白给出不同的电化学检测峰电流。综上，石墨烯修饰电极有望用于钙卫蛋白的临床检验。参考文献：[1]PoullisA,FosterR,ShettyA,etal.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.,2004,13(2):279-284.[2]郭汉斌,曹建彪,王志红等,胃肠病学和肝病学杂志,2009,18(8):744-747.[3]TibbleJ,SigthorssonG,FosterR,etal.Gut,2001,49(3):402-408.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用，采用石墨烯修饰电极既利于钙卫蛋白及其抗体的吸附又能提高电极的导电性，因此该免疫传感器具有灵敏度高、稳定性好、快速定量检测、抗干扰能力强、成本低、使用方便且制备过程简单的特点，可广泛地用于疑似结直肠癌患者的粪便钙卫蛋白检查。本专利技术的技术方案是：一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，包括如下步骤：(1)石墨烯修饰电极的制备将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；(2)为了提高修饰电极的稳定性，将步骤(1)制得的修饰电极继续滴涂壳聚糖乙酸溶液；(3)电极上氧化石墨烯的电化学还原将步骤(2)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对钙卫蛋白抗体的吸附性能，增大钙卫蛋白抗体在电极上的吸附量；(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺活化电极表面的羧基将4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液滴涂到步骤(3)制得的修饰电极上，并在室温下活化1～3小时；(5)修饰钙卫蛋白抗体将5～7μL浓度为25～300μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液滴加到步骤(4)制得的电极表面，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液洗去未与电极结合牢固的钙卫蛋白抗体；(6)封闭电极非特异性活性位点用4～6μL浓度为0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封闭步骤(5)制得电极的表面非特异性活性位点，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极结合牢固的牛血清白蛋白；(7)修饰钙卫蛋白将5～7μL浓度为10～200ng/mL的一系列不同浓度的钙卫蛋白用于和电极上抗体特异性识别，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极上抗体结合牢固的钙卫蛋白，于4℃冰箱中储存备用。所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.05mg/ml～5mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为0.5～20μL。所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下步骤：/n(1)石墨烯修饰电极的制备/n将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；/n(2)为了提高修饰电极的稳定性，将步骤(1)制得的修饰电极继续滴涂壳聚糖乙酸溶液；/n(3)电极上氧化石墨烯的电化学还原/n将步骤(2)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对钙卫蛋白抗体的吸附性能，增大钙卫蛋白抗体在电极上的吸附量；/n(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺活化电极表面的羧基/n将4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液滴涂到步骤(3)制得的修饰电极上，并在室温下活化1～3小时；/n(5)修饰钙卫蛋白抗体/n将5～7μL浓度为25～300μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液滴加到步骤(4)制得的电极表面，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液洗去未与电极结合牢固的钙卫蛋白抗体；/n(6)封闭电极非特异性活性位点/n用4～6μL浓度为0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封闭步骤(5)制得电极的表面非特异性活性位点，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极结合牢固的牛血清白蛋白；/n(7)修饰钙卫蛋白/n将5～7μL浓度为10～200ng/mL的一系列不同浓度的钙卫蛋白用于和电极上抗体特异性识别，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极上抗体结合牢固的钙卫蛋白，于4℃冰箱中储存备用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)石墨烯修饰电极的制备
将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；
(2)为了提高修饰电极的稳定性，将步骤(1)制得的修饰电极继续滴涂壳聚糖乙酸溶液；
(3)电极上氧化石墨烯的电化学还原
将步骤(2)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对钙卫蛋白抗体的吸附性能，增大钙卫蛋白抗体在电极上的吸附量；
(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺活化电极表面的羧基
将4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液滴涂到步骤(3)制得的修饰电极上，并在室温下活化1～3小时；
(5)修饰钙卫蛋白抗体
将5～7μL浓度为25～300μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液滴加到步骤(4)制得的电极表面，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液洗去未与电极结合牢固的钙卫蛋白抗体；
(6)封闭电极非特异性活性位点
用4～6μL浓度为0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封闭步骤(5)制得电极的表面非特异性活性位点，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极结合牢固的牛血清白蛋白；
(7)修饰钙卫蛋白
将5～7μL浓度为10～200ng/mL的一系列不同浓度的钙卫蛋白用于和电极上抗体特异性识别，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：英哲，张睿，杨卫东，郝亚斌，孙宝明，刘放，王永鹏，曾尤，成会明，
申请(专利权)人：中国科学院金属研究所，辽宁省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21