一种筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的方法技术

本发明专利技术提供了一种筛选PD‑L1/PD‑1检测点抑制剂的方法。具体地，包括步骤：(a)提供一个表达PD‑1的细胞株和表达PD‑L1的细胞株的共培养体系；(b)分别在测试组和对照组中，向所述共培养体系中添加候选组合物，并观察所述测试组和对照组中PD‑1的表达量和/或PD‑L1的糖基化情况。本发明专利技术的优点在于吻合生理过程，操作简便，成本低，高效率，结果准确度高，且能直观地反映药物对PD‑L1/PD‑1蛋白相互作用或PD‑L1蛋白膜转移的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的方法。
技术介绍
“免疫逃逸”是肿瘤的一大特征。机体的免疫系统在肿瘤发生初期可通过识别和清除癌变细胞来降低肿瘤发生率。而肿瘤细胞可通过调整自身或肿瘤微环境的状态来实现免疫逃逸，规避免疫杀伤。免疫检测点在调控免疫应答、维持对自身抗原的免疫耐受过程中担任着重要的角色。上调免疫检测点抑制分子的表达，是肿瘤细胞规避免疫杀伤的一种常见机制。通过拮抗免疫检测点信号通路可有效地抑制肿瘤生长。免疫治疗正在成为肿瘤治疗的重要方法。PD-1(Programmedcelldeathprotein1，又称CD279)，是目前最受关注的免疫检测点受体之一。它是由PDCD1基因编码表达含288个氨基酸的I型跨膜蛋白，属于CD28/CTLA-4免疫球蛋白超级家族，主要表达在活化的成熟T细胞中。PD-L1(Programmeddeath-ligand1，又称CD274，B7-H1)，是由CD274基因编码表达的含290个氨基酸的免疫球蛋白样I型跨膜蛋白，是PD-1的主要配体，目前已发现过表达于多种恶性肿瘤细胞中，包括淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、卵巢癌、肾癌和膀胱癌等。PD-L1与PD-1的结合可介导后者胞内域发生磷酸化，以此招募胞质中的SHP-2磷酸酶对邻近的TCR通路分子去磷酸化从而抑制TCR下游信号通路，最终导致T细胞功能衰竭(Tcellexhaustion)。自2013年起，靶向PD-L1/PD-1通路的药物研发逐渐成为肿瘤免疫治疗的热点，主要的策略是通过设计抗体阻断PD-L1与PD-1的结合，解除PD-1通路对T细胞的抑制。截止至2018年6月，已有5个PD-L1/PD-1抗体或FDA批准上市，它们在临床上取得了突破性的治疗效果，尤其是针对晚期或转移性癌症的治疗。但同时，抗体类药物本身存在许多限制，比如其局限于静脉注射的单一用药方式、免疫原性、弱组织渗透性、低稳定性和高成本等。因此，其它类型尤其是小分子药物的开发显得日趋重要。尽管在目前而言，小分子化合物的开发远远滞后于抗体类药物，但随着PD-L1/PD-1复合物结构的细节被揭露，开发可有效阻断PD-L1/PD-1相互作用的小分子抑制剂已成为可能。与开发PD-L1/PD-1抑制剂的巨大需求相对应的是目前尚不健全的筛选方法。目前已有多种结构的小分子化合物出现在已发表的专利或文献中，但鲜少有进一步的报道。它们在临床前研究中的失败大部分归咎于所使用的筛选方法。它们大多数都是基于检测体外的同源蛋白结合的筛选原理，比如最常用的HTRF法(结合时间分辨荧光分析法(TRF,time-resolvedfluoroimmunoassay)和荧光能量共振转移(FRET)的一种方法)和体外蛋白竞争实验，这些体外检测方法虽然具备极高的敏感性，但与生理状况相去甚远，容易得到假阳性的结果；另外，通过检测T细胞效应功能(如ELIZA检测IFN-γ水平或CFSE法检测T细胞扩增)来筛选也是常见的手段，但影响T细胞效应改变的机理复杂多样，这些方法并不能直观地反映药物对PD-L1/PD-1检测点的影响。由此可见，如何能更有效、准确地评估候选抗体或化合物针对PD-L1/PD-1相互作用的方法，成为一个亟待解决的问题。因此，本领域迫切需要开发一种便捷、有效、准确地筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种便捷、有效、准确地评估候选药物抑制PD-L1/PD-1相互作用和信号转导的药物筛选和评价体系。在本专利技术的第一方面，提供了一种筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的候选组合物的方法，包括步骤：(a)提供一培养体系，所述培养体系为表达PD-1的细胞株和表达PD-L1的细胞株的共培养体系；(b)在测试组中，向所述培养体系中添加候选组合物，并观察所述测试组PD-1的表达量和/或PD-L1的糖基化情况；在对照组中，在相同培养体系中不添加所述的候选组合物，并观察所述对照组中PD-1的表达量和/或PD-L1的糖基化情况；其中，如果测试组培养体系中PD-1的表达量P1a显著高于对照组P0a，则说明所述候选组合物为PD-L1/PD-1检测点抑制剂；如果测试组培养体系中PD-L1的糖基化情况改变，则说明所述候选组合物为PD-L1/PD-1检测点。在另一优选例中，所述PD-L1/PD-1检测点抑制剂为膜转移抑制剂。在另一优选例中，所述表达PD-1的细胞株包括：Jurkat/PD-1、经细胞因子(IL-2等)、离子霉素联合佛波酯或抗CD3抗体联合抗CD28抗体刺激后上调PD-1的Jurkat细胞、MOLT-4和RPMI-8226。在另一优选例中，所述表达PD-L1的细胞株包括：PC-9/PD-L1、H1975、H460、H2228、Hcc827、MDA-MB-231、A2058、A375、SK-MEL-5、NCI-H226、EBC-1、HDLM-2、U-251MG、U-138MG、CAPAN-2、TIME、SK-BR-3和A431。在另一优选例中，所述培养体系为Jurkat/PD-1与PC-9/PD-L1的共培养体系。在另一优选例中，所述“显著高于”指P1a/P0a的比值大于1，较佳地≥2，更佳地≥4。在另一优选例中，所述PD-L1的糖基化情况包括PD-L1蛋白的westernblot条带分布的改变。在另一优选例中，所述PD-L1的糖基化情况包括55kD的PD-L1蛋白水平下降。在另一优选例中，所述PD-L1的糖基化情况包括43kD的PD-L1蛋白水平增加。在另一优选例中，所述PD-1来源于哺乳动物；优选地，来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地，来源于人。在另一优选例中，所述PD-1包括PD-1的蛋白、编码核酸、活性片段或其衍生物。在另一优选例中，所述PD-L1/PD-1检测点抑制剂包括PD-1抗体、或PD-L1/PD-1的活性抑制剂。在另一优选例中，所述PD-L1/PD-1检测点抑制剂选自下组：购自Selleck公司的两个小分子化合物(PD-1/PD-L1inhibitor1和BMS-202)和一个环肽类抑制剂(PD-1/PD-L1inhibitor3)及其结构类似物。在另一优选例中，所述PD-L1/PD-1检测点抑制剂抑制PD-1的溶酶体降解，表现为PD-1的表达量增加。在另一优选例中，所述PD-L1的抑制剂选自下组：Bristol-MyersSquibb开发的化合物no.1166(US2015/0291549A1)及其结构类似物。在另一优选例中，所述方法是非诊断性和非治疗性方法。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的候选组合物的方法，其特征在于，包括步骤：/n(a)提供一培养体系，所述培养体系为表达PD-1的细胞株和表达PD-L1的细胞株的共培养体系；/n(b)在测试组中，向所述培养体系中添加候选组合物，并观察所述测试组PD-1的表达量和/或PD-L1的糖基化情况；在对照组中，在相同培养体系中不添加所述的候选组合物，并观察所述对照组中PD-1的表达量和/或PD-L1的糖基化情况；/n其中，如果测试组培养体系中PD-1的表达量P1a显著高于对照组P0a，则说明所述候选组合物为PD-L1/PD-1检测点抑制剂；/n如果测试组培养体系中PD-L1的糖基化情况改变，则说明所述候选组合物为PD-L1/PD-1检测点。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选PD-L1/PD-1检测点抑制剂的候选组合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一培养体系，所述培养体系为表达PD-1的细胞株和表达PD-L1的细胞株的共培养体系；
(b)在测试组中，向所述培养体系中添加候选组合物，并观察所述测试组PD-1的表达量和/或PD-L1的糖基化情况；在对照组中，在相同培养体系中不添加所述的候选组合物，并观察所述对照组中PD-1的表达量和/或PD-L1的糖基化情况；
其中，如果测试组培养体系中PD-1的表达量P1a显著高于对照组P0a，则说明所述候选组合物为PD-L1/PD-1检测点抑制剂；
如果测试组培养体系中PD-L1的糖基化情况改变，则说明所述候选组合物为PD-L1/PD-1检测点。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PD-L1/PD-1检测点抑制剂为PD-L1糖基化抑制剂。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达PD-1的细胞株包括：Jurkat/PD-1、经细胞因子、离子霉素联合佛波酯或抗CD3抗体联合抗CD28抗体刺激后上调PD-1的Jurkat细胞、MOLT-4和RPMI-8226。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达PD-L1的细胞株包括：PC-9/PD-L1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞强，陈芳芳，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31