一种稀有肿瘤细胞富集方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种稀有肿瘤细胞的富集方法，包括如下步骤，用粘附剂包被细胞分离载体，将待富集的样品加入包被后的载体中，将加样后的多孔培养板进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。本发明专利技术利用包被的粘附剂层形成粘性界面，而且肿瘤细胞表面粘附性蛋白的表达量较白细胞高，粘附能力较白细胞更强，在同等条件下，肿瘤细胞先被粘附，白细胞未粘附而被去除，从而达到富集目的。本发明专利技术还公开了用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒。本发明专利技术所述的富集方法操作简单，富集效果好，白细胞去除率和肿瘤细胞回收率高，有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种稀有肿瘤细胞富集方法及试剂盒
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种稀有肿瘤细胞富集方法、富集用试剂盒以及牛血清白蛋白在制备该试剂盒中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸水、腹水、脑脊液等。因此，在此类样本中对肿瘤细胞进行检测是判定肿瘤存在、转移的关键，具有重要的临床意义。例如，循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)主要指为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。透过基底膜进入血液后，少数CTCs能逃避机体的免疫杀伤而存活下来，部分肿瘤细胞团也可以直接从原发灶脱离并进入循环系统，形成循环肿瘤微栓。血中的CTCs不仅具有循环的特性，还保留了原始肿瘤细胞的生物学特性，包括细胞体积、表面蛋白及糖蛋白、电荷等特性。这些CTCs和CTM随血液播散后可在其他部位形成新的转移灶，与肿瘤的转移和复发密切相关。因而CTCs的检测及分析在微转移灶早期发现、疗效评估与个体化治疗等方面具有重要临床应用价值。但是，这类样本中的肿瘤细胞通常数量非常稀少，例如CTCs在外周血中十分稀少，大约为每1010(100亿)个血细胞或每108-9个白细胞中存在1个CTC。因此，稀有肿瘤细胞的富集是一切研究工作的基础，目前，如何从恶性肿瘤患者体液样本中分离稀有肿瘤细胞，从而中得到更多的诊断信息和治疗信息是生物医学领域面临的共同挑战。现有的稀有肿瘤细胞富集方法主要有以下几种：a)基于生物学特性-蛋白表达：包括正向富集(使用表面蛋白抗体结合稀有肿瘤细胞，如Epcam抗体)，或者负向富集(CD45抗体结合白细胞等非稀有肿瘤细胞，再利用磁珠去除白细胞，达到富集目的)。b)基于物理特性-大小、电荷：包括膜过滤、芯片过滤、密度梯度离心、介电电泳等。膜过滤和芯片过滤是指利用肿瘤细胞比白细胞体积大，使用带固定孔隙的膜或芯片进行过滤，得到体积较大的细胞；密度梯度离心是使用固定的密度分离液，将肿瘤细胞与其他单个核细胞进行分离，去除了除单个核细胞以外的红细胞及白细胞；介电电泳法是基于细胞的介电性质例如膜容量、膜阻抗和胞质电导率是随细胞结构和活动而变化，不同细胞有不同的介电性质，经测定证明肿瘤细胞的电容远大于各种血细胞，因此可通过介电性质的不同将肿瘤细胞与其他各种血细胞进行分离。c)基于物理特性结合生物学特性：例如droplet微滴芯片、微流控。但是，上述方法中，基于抗原抗体结合从而进行富集的方法如细胞表面蛋白EpCAM等这类标志物富集稀有肿瘤细胞的特异性欠佳，部分正常内皮细胞也会表达上皮型标志物，甚至有研究表明极少数中性粒细胞也会表达；而且，这类标志物只表达在部分上皮源性的恶性肿瘤(癌)中，无法用于间叶组织源性的恶性肿瘤，并且即使是源自上皮组织的恶性肿瘤，研究也证实肿瘤细胞亦会在转移、进展和治疗等情况下发生EMT而导致该类标志物的表达降低甚至缺失，从而导致漏检。此外也有文献报道，循环肿瘤细胞在与抗体结合后改变其原有的信号通路；采用类似的方法，通过耗尽CD45阳性白细胞来富集稀有肿瘤细胞，但相当一部分白细胞只有低水平的表面标志物表达，导致富集的效率欠佳。此外，基于生物学特性的富集需要使用的抗体量较大，抗体使用的价格较高，限制大规模的临床使用。且分离后的细胞可能会因为磁珠无法与细胞完全分离干净而导致细胞完整性和活性受到破坏，导致捕获细胞的再利用受到一定影响。基于细胞大小或介电性质等物理特性的富集方法，由于稀有肿瘤细胞和外周血单个核细胞(PBMC)大小之间存在相当大的重叠，这些方法虽然可以富集一定纯度的稀有肿瘤细胞，但纯粹基于大小的分离可能造成部分体积较小的细胞的丢失，即损失了用于下游分析的重要转移信息；而基于介电性质的富集方法首先要用密度梯度法富集细胞，这可能造成稀有肿瘤细胞细胞的丢失，并且各种肿瘤细胞的介电性不同，并不适用于所有的肿瘤细胞，适用面窄。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种稀有肿瘤细胞富集方法、富集用试剂盒、粘附剂在制备上述试剂盒中的用途、用于稀有肿瘤细胞富集的细胞分离载体、以及改善肿瘤细胞粘附性的方法。本专利技术的第一方面，提供一种稀有肿瘤细胞富集方法，包括如下步骤：S1.包被：用粘附剂包被细胞分离载体，形成包被层；S2.加样：将待富集的样品加入包被后的载体中；S3.富集：将载体中的样品进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。根据本专利技术，所述方法还包括步骤S4：弃去上层液体，获得富集的稀有肿瘤细胞。根据本专利技术，所述粘附剂可以选自牛血清白蛋白(BSA)，多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种；优选牛血清白蛋白。根据本专利技术，所述载体可以为多孔培养板、酶标板、细胞离心管、玻片、PDMS芯片、仿生生物膜、玻璃芯片、纸芯片、细胞培养微流控芯片等中的一种。所述多孔培养板或酶标板没有特别的限定，可以为本领域已知的各种类型和规格；作为本专利技术的一个实施方式，所述多孔培养板为96孔板或48孔板。根据本专利技术，所述稀有肿瘤细胞的来源并没有特别限定，例如可以为来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、间质瘤、胶质瘤中一种或两种以上的肿瘤细胞。根据本专利技术，所述步骤S1为将粘附剂溶于无菌水，配成溶液，加至载体中，干燥至表面无液体流动。根据本专利技术，所述干燥为水浴箱中温干；优选地，所述干燥温度为37℃。根据本专利技术，所述载体在干燥前可封上封板纸。根据本专利技术，所述步骤S1的粘附剂溶液质量浓度为0.1％-75％。作为本专利技术的一个实施方案，所述步骤S1的粘附剂为0.1％-10％的多聚赖氨酸，优选0.3-5％，例如1％、1.5％、2％、3％、4％。作为本专利技术另一实施方案，所述步骤S1的粘附剂为10％-75％的牛血清白蛋白，优选15％-50％，例如20％、25％、30％、35％、40％。根据本专利技术，所述粘附剂溶液的使用量为每孔2-5μL，例如为4μL。根据本专利技术，所述步骤S2中样品为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中、肿瘤组织、肿瘤活检物和/或组织试样的一种。根据本专利技术，所述步骤S2包括将去除全血中红细胞后重悬的步骤；所述红细胞可通过本领域已知的方法去除，例如红细胞裂解、密度梯度离心、Ficoll分离法或者免疫磁珠分离法等。根据本专利技术，所述步骤S2中，每个多孔培养板孔中加入样品的量为100-220μL，例如200μL。根据本专利技术，所述步骤S3中，离心力为10g-150g，例如为20-90g、25g-70g、35g-50g；具体地，例如为35g、40g、50g、70g。根据本专利技术，所述步骤S3的富集处理为采用离心力、负压或者脉冲电场，促使稀有肿瘤细胞粘附于包被层；作为一个具体实施方式，将加样的载体例如多孔培养板、酶标板或细胞离心管进行离心。根据本专利技术，所述步骤S3中，离心时间为1-5min，例如为1-3min；具体地，例如为1min、2mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.包被：用粘附剂包被细胞分离载体，形成包被层；/nS2.加样：将待富集的样品加入包被后的载体中；/nS3.富集：将载体中的样品进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.包被：用粘附剂包被细胞分离载体，形成包被层；
S2.加样：将待富集的样品加入包被后的载体中；
S3.富集：将载体中的样品进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。


2.根据权利要求1所述的稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述方法还包括步骤S4：弃去上层液体，获得富集的循环肿瘤细胞；优选地，粘附剂选自牛血清白蛋白(BSA)，多聚赖氨酸，Fn纤维连接蛋白、胶原蛋白中的至少一种。


3.根据权利要求1或2所述的稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、间质瘤、胶质瘤中一种或两种以上的肿瘤细胞；优选地，所述载体为多孔培养板、酶标板、细胞离心管、玻片、PDMS芯片、仿生生物膜、玻璃芯片、纸芯片、细胞培养微流控芯片等中的一种。


4.根据权利要求1-3任一项所述的稀有肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述步骤S1为将粘附剂溶于无菌水，配成溶液，加至多孔培养板中，干燥至表面无液体流动；
优选地，所述步骤S1所述粘附剂溶液质量浓度为0.1％-75％；
优选地，所述粘附剂溶液的使用量为每孔2-5μL。


5.根据权利要求1-4任一项所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述步骤S2中样品为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中的一种；
优选地，所述步骤S2包括将全血加入红细胞裂解液后重...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑磊，司徒博，叶昕怡，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44