一种液相色谱串联质谱法检测意蜂蜜和中蜂蜜中王浆主蛋白5的方法技术

本发明专利技术提供一种液相色谱串联质谱法检测中蜂蜜和意蜂蜜的王浆主蛋白5(MRJP5)的方法，包括：筛选分别属于中蜂MRJP5和意蜂MRJP5的特征肽段，建立液相色谱串联质谱检测方法，蜂蜜样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，数据分析等步骤；所述特征肽段包括意蜂MRJP5特征肽段：YLDYDFGSDER和中蜂MRJP5特征肽段：NLANSMNVIHEWK。本发明专利技术所提出的蜂蜜中MRJP5的检测方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于鉴别意蜂蜜和中蜂蜜，尤其适用于中蜂蜜混入意蜂蜜的掺假鉴别。该方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱串联质谱法检测意蜂蜜和中蜂蜜中王浆主蛋白5的方法
本专利技术涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱法检测蜂蜜中王浆主蛋白5的方法，该方法适用于鉴别中蜂蜜和意蜂蜜。
技术介绍
蜂蜜是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜，与自身分泌物相混合、经充分酿造贮存在蜂巢中的一种天然甜味物质。蜂蜜中含有丰富的氨基酸、酚酸、黄酮、微量元素等对人有益的物质，这使其具有润肠、美容和保健等功效，深受人们喜爱。根据蜜源植物的不同，蜂蜜可以分为洋槐蜜、椴树蜜、枣花蜜、荆条蜜、荔枝蜜、龙眼蜜等单花蜜品种。根据蜜蜂种类的不同，可以分为西方蜜蜂、东方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、黑小蜜蜂、黑大蜜蜂、无刺蜂等蜜蜂酿制的蜂蜜。当前，已经人工驯化的蜜蜂，并且实现大规模生产蜜蜂的蜜蜂品种主要是以意大利蜜蜂为代表的西方蜜蜂和以中华蜜蜂为代表的东方蜜蜂，其它蜜蜂品种尚未人工驯化，难以开展规模化养殖。目前，中蜂蜜由于口感佳，深受人们喜爱，但是中蜂蜜产量较低，仅仅是我国商品蜂蜜的有效补充，也因此其售价往往是意蜂蜜的5-10倍。不良企业为了追去高额利润，往往制售掺假中蜂蜜，其掺假的形式主要是在中蜂蜜中混入廉价的意蜂蜜。当前，尚未有任何有关中蜂蜜真实性的标准或掺假鉴别方法，如何评价中蜂蜜的真实性，鉴别中蜂蜜掺假，已经成为蜂产品行业广大从业者共识。蜜蜂在酿制蜂蜜的过程中会混入少量的酶类、蛋白质等物质，由于蜜蜂种类的不同，酿制的蜂蜜中含有的蛋白质也会有所不同。王浆主蛋白(MRJPs)是蜂蜜中蛋白质的主要组成成分，中蜂和意蜂酿制的蜂蜜虽然均含有MRJPs，但是两者的氨基酸序列存在差异。通过检测中蜂蜜和意蜂蜜中的同源性蛋白质可以有效的鉴别蜜蜂的品种，从而对酿制的蜜蜂进行品种溯源，进而用来中蜂蜜真实性的评价和惨假鉴别方法的开发。本专利技术针对蜂蜜丰度较高的MRJP5，基于液相串联质谱开发了中蜂和意蜂MRJP5的检测方法。建立的方法尤其适用于中蜂蜜中意蜂蜜掺假的鉴别，这对保护中蜂蜜产业的发展具有重大的现实意义。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种液相色谱串联质谱法检测蜂蜜中王浆主蛋白5的方法。该方法可用于生产和商业中对中蜂蜜和意蜂蜜进行鉴定。第一方面，本专利技术筛选出可用于液相色谱串联质谱鉴定中蜂蜜和意蜂蜜的王浆主蛋白5（MRJP5）的特征肽段组：意蜂蜜MRJP5的特征肽段：YLDYDFGSDER，中蜂蜜MRJP5的特征肽段：NLANSMNVIHEWK。本专利技术根据意蜂蜜和中蜂蜜酶解产物的纳升级高效液相色谱液相色谱串联质谱检测结果，成功筛选出意蜂蜜特征肽段：YLDYDFGSDER，中蜂蜜特征肽段：NLANSMNVIHEWK，两者特异性通过Uniprot数据库进行了验证。进一步，意蜂蜜的MRJP5的特征肽段YLDYDFGSDER在质谱中所产生的检测信号的母离子具有690.29114的质荷比，包含质荷比为1103.42761、710.31039的子离子。中蜂蜜的MRJP5的特征肽段NLANSMNVIHEWK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有519.26104的质荷比，包含质荷比为712.37769、599.29362的子离子。第二方面，本专利技术提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中MRJP5的方法。具体地，所述方法具体步骤如下：A、根据筛选出的专属于意蜂蜜的MRJP5的特征肽段和中蜂蜜的MRJP5的特征肽段的母离子质荷比、子离子质荷比、碰撞能等信息建立液相色谱串联质谱检测方法；B、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；C、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。进一步地，步骤A和B中采用UHPLC-QExactiveplus进行液相色谱串联质谱检测。a1、液相色谱条件如下：色谱柱：为C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5min，5%的B；0.5-1.0min，5-15%的B；1.0-6.5min，15-40%的B；6.5-7.0min，40-95%的B；7.0-8.5min，95%的B；8.5-8.6min，95-5%B，8.6-10.0min，5%的B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0µL；a2、质谱条件如下：离子源：纳升电喷雾离子源；一级扫描方式：正离子扫描；扫描分辨率：120000；自动增益控制（AGCTarget）：3e6；扫描范围：300~1800m/z；动态隔离窗口：20s。二级扫描参数：裂解模式：高能碰撞诱导解离模式（HCD）；扫描分辨率：17500；扫描范围：200~2000m/z；Loopcount：20；MSXcount：1；最大离子注入时间：35ms；自动增益控制（AGCTarget）：1e5；隔离窗口：2.0m/z。该方法采用UHPLC-QExactivePlus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过在待测样品的质谱图中提取属于中蜂MRJP5特征肽段和意蜂MRJP5特征肽段的质荷比，若待测样品在正确的保留时间中仅提取出中蜂MRJP5特征肽段，且子离子也符合，则可判断为中蜂蜜；若待测样品在正确的保留时间中仅提取出意蜂MRJP5特征肽段，且子离子也符合，则可判断为意蜂蜜；若待测样品在正确的保留时间中同时提取出中蜂和意蜂MRJP5特征肽段，且子离子也符合，则判断为中、意蜂蜜混掺。应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本专利技术保护范围。本专利技术采用UHPLC-QExactiveplus仪器检测蜂蜜中的MRJP5，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。本专利技术提供一种液相色谱串联质谱检测中蜂蜜和意蜂蜜MRJP5的方法，至少具有如下有益效果：本专利技术经研究发现，意蜂MRJP5和中蜂MRJP5的氨基酸位点有区别，可以确定各自的特异性的肽段，并据此建立起一套鉴别中蜂蜜和意蜂蜜的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本专利技术提供的中、意蜂蜜中MRJP5的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益有重要意义。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC-QExactiveplus提取的意蜂MRJP5特征肽段和中蜂MRJP5的特征肽段的离子流图；图2为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC-QExactiveplus检测的意蜂MRJP5特征肽段和中蜂MRJP5的特征肽段的质谱图；图3为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC-QExactiveplus检测的意蜂MRJP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液相色谱串联质谱法检测中蜂蜜和意蜂蜜的王浆主蛋白5的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中MRJP5的特征肽段，所述特征肽段包括肽段：/n意蜂蜜特征肽段：YLDYDFGSDER；/n中蜂蜜特征肽段：NLANSMNVIHEWK。/n

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱串联质谱法检测中蜂蜜和意蜂蜜的王浆主蛋白5的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中MRJP5的特征肽段，所述特征肽段包括肽段：
意蜂蜜特征肽段：YLDYDFGSDER；
中蜂蜜特征肽段：NLANSMNVIHEWK。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
A、对真实的中蜂蜜和意蜂蜜进行酶解，酶解产物除盐后干燥，用0.1%的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；
B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出专属于意蜂蜜的MRJP5的特征肽段和中蜂蜜的MRJP5的特征肽段；
C、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；
D、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。

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【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，丛晓蕾，张金震，周金慧，杨宇晖，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11