一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，提供了一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法，所涉及的高产纳豆激酶的菌株，经16SrDNA鉴定为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株代码为YJY20‑05，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.20017。该菌株应用于纳豆激酶液体发酵中酶活较原始菌株发酵水平提高1倍、时间缩短1倍，纳豆激酶提取纯化后,先制成微胶囊后与卵磷脂复合制备纳豆激酶片，可获得纳豆激酶含量为2000FU/片、卵磷脂含量0.3g/片的纳豆激酶片剂，既保证了纳豆激酶的活性又强化了预防和治疗血栓性疾病的功能。

【技术实现步骤摘要】
一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法
本专利技术属于生物工程
，提供了一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法。
技术介绍
血栓性疾病是一般由血液中的血小板、纤维蛋白、白细胞等物质粘联而形成的血栓，随着血栓的不断增大，造成了血管阻塞甚至封闭，使机体的一些器官因缺血而引发功能性障碍的各种疾病。血栓性疾病的致残和致死的概率都较高，是一种严重危害人类健康和生命的疾病。据报道，中国血栓性疾病的患者已经达到1000万以上，并且每年新增的患者大约有150～200万人，每年都有超过300万人进行血栓治疗。伴随着老龄化社会的到来，估计患病人数会有进一步的增加，所以血栓性疾病已经是对我们健康威胁的主要疾病之一。纳豆激酶(nattokinase，NK)是由纳豆枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilisnatto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，易溶于水，固态呈淡黄色或白色，无二硫键，一般为单链多肽结构。纳豆激酶的脱氧核糖核酸序列由275个氨基酸残基构成，相对分子质量一般为28000u。该酶N末端为丙氨酸，等电点为8.6±0.3。在室温下，酶活性在pH值6.0～12.0的范围内具有很强的纤维蛋白水解能力，酶反应的最适pH值一般为8，酸性和强碱性条件下会迅速失活。其酶活力不易受反复冻融影响，温度达50℃以上时酶活性会逐渐丧失，超过60℃酶迅速失活，其最适温度为45℃。纳豆激酶具有良好的溶解血栓的功效，与传统的溶栓药物链激酶、尿激酶相比具有药理作用直接且多元化、体内半衰期长、分子量相对较小可直接通过胃肠系统被人体吸收、安全性高、价格便宜等诸多优点。KimJ.Y.etal.Effectsofnattokinaseonbloodpressure:arandomized,controlledtrial.研究表明20～80岁高血压患者口服纳豆激酶胶囊(2000FU/天)8周后，舒张压和收缩压均较对照组(服用安慰剂)明显降低。然而目前国内的纳豆激酶产品活性普遍比较低,筛选具有高活力纳豆激酶生产能力的菌株及制备高活性的纳豆激酶活性产品,作为预防和治疗血栓性疾病具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术存在的不足，提供一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法，所涉及的高产纳豆激酶的菌株，经16SrDNA鉴定为一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，菌株代码为YJY20-05，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.20017。该菌株应用于纳豆激酶液体发酵中酶活较原始菌株发酵水平提高1倍、时间缩短1倍，纳豆激酶提取纯化后,先制成微胶囊后与卵磷脂复合制备纳豆激酶片，可获得纳豆激酶含量为2000FU/片、卵磷脂含量0.3g/片的纳豆激酶片剂，既保证了纳豆激酶的活性又强化了预防和治疗血栓性疾病的功能。本专利技术提供的具体技术方案是：本专利技术首先提供了一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌株来源与市场上的原始菌株，其具体获得过程如下：采集市售纳豆样品，从其中分离纯化单菌落，采用常规诱变方法，如UV，DMS，MMS，NTG等，结合ARTP诱变系统，反复多次诱变，经过酪素培养基初筛、琼脂糖—纤维蛋白原平板复筛，并对其生理生化特性、遗传稳定性深入研究后，最终筛选出一株发酵高产纳豆激酶、易培养且具有遗传稳定性的菌株，将其命名为YJY20-05，专利技术人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为CGMCCNO.20017，经检测其为存活状态；该菌株的形态特征为：无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌；该菌株在普通营养琼脂上形成表面粗糙不透明、污白色或微黄色、有褶皱的菌落。专利技术人同时对菌株YJY20-05进行了16SrDNA测序，其序列如SeqIDNo：1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列。将所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株YJY20-05的16SrDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属(Bacillussp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的菌株有100％的同源性；因此鉴定其为一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。获得上述菌株后，可以利用该菌株进行纳豆激酶相关产品的生产，具体步骤包括：(1)纳豆激酶发酵液的制备：包括种子制备、液体深层发酵；(2)纳豆激酶精品液的制备：包括纳豆激酶的纯化；(3)纳豆激酶片剂的制备：包括纳豆激酶微胶囊干粉的制备、纳豆激酶片剂的制备。上述的发酵液、微胶囊干粉和片剂均可以作为产品直接销售；更进一步的，其中所述纳豆激酶发酵液的制备包括以下步骤：1)种子制备：在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用接种针刮取1环到100mlLB培养基中，摇床温度33℃～37℃、转速160r/min～200r/min，振荡培养18～24h，检测OD600＝0.5～0.8时停止培养，得到种子液；2)液体深层发酵：取制备好的种子液，按照1％～5％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基中，进行深层发酵，获得纳豆激酶发酵液；液体深层发酵培养基组成和发酵条件如下：液体深层发酵培养基组成，按重量百分比计为：葡萄糖0.8％～2％、木糖1％～3％、大豆蛋白胨1％～2％、硫酸铵0.3％～0.8％、氯化钙0.01％～0.03％、硫酸氢二钠0.08％～0.13％、硫酸二氢钠0.05％～0.08％、氯化亚铁0.003％～0.005％、豆油0.5％～1％，加水至1000mL，pH7.2～7.4；液体深层发酵条件为：培养温度33℃～37℃，摇床转速160r/min～200r/min，培养时间为32～40h，检测纳豆激酶含量达到1053～1214FU/mL停止发酵，发酵纳豆激酶含量较原始菌株467～521FU/mL提高1倍、发酵时间较原始菌株72～96h缩短1倍；上述纳豆激酶含量的检测方法为紫外分光光度法。所述纳豆激酶精品液的制备包括以下步骤：取纳豆激酶发酵液，4000～6000rpm离心15～25min，取上清液；选用截留分子量为100KD的滤膜，在0.05～0.20MPa，10～35℃，pH6～8条件下超滤，收集过滤液；选用截留分子量为1KD的超滤膜，在0.05～0.20MPa，10～35℃，pH6～8条件下超滤，收集1KD超滤膜截留液，即为精品纳豆激酶液，经过检测其纳豆激酶含量为2578～2961FU/mL；所述纳豆激酶精品液的制备中，纳豆激酶发酵液离心和过100KD滤膜能除去发酵液中大部分的杂质和菌体，100KD滤膜过滤液过1KD超滤膜能除去部分小分子的呈味物质，有效去除纳豆激酶产品的刺激性气味；同时上述制备工艺条件更加简单，且大大降低了生产成本。所述纳豆激酶片剂的制备包括以下步骤：1)纳豆激酶微胶囊干粉的制备纳豆激酶微胶囊的制备：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产纳豆激酶的菌株，保藏编号为CGMCC NO.20017，命名为YJY20-05，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。/n

【技术特征摘要】
1.一株高产纳豆激酶的菌株，保藏编号为CGMCCNO.20017，命名为YJY20-05，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。


2.根据权利要求1所述的高产纳豆激酶的菌株，其特征在于：其16SrDNA的核苷酸序列如SeqIDNo:1所示。


3.利用权利要求1所述菌株进行纳豆激酶相关产品的生产方法，其特征在于：具体步骤包括：
(1)纳豆激酶发酵液的制备：包括种子制备、液体深层发酵；
(2)纳豆激酶精品液的制备：包括纳豆激酶的纯化；
(3)纳豆激酶片剂的制备：包括纳豆激酶微胶囊干粉的制备、纳豆激酶片剂的制备。


4.根据权利要求3所述的纳豆激酶相关产品的生产方法，其特征在于：
所述纳豆激酶发酵液的制备包括以下步骤：
1)种子制备：在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用接种针刮取1环到100mlLB培养基中，摇床温度33℃～37℃、转速160r/min～200r/min，振荡培养18～24h，检测OD600＝0.5～0.8时停止培养，得到种子液；
2)液体深层发酵：取制备好的种子液，按照1％～5％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基中，进行深层发酵，获得纳豆激酶发酵液；
液体深层发酵培养基组成和发酵条件如下：
液体深层发酵培养基组成，按重量百分比计为：葡萄糖0.8％～2％、木糖1％～3％、大豆蛋白胨1％～2％、硫酸铵0.3％～0.8％、氯化钙0.01％～0.03％、硫酸氢二钠0.08％～0.13％、硫酸二氢钠0.05％～0.08％、氯化亚铁0.003％～0.005％、豆油0.5％～1％，加水至1000mL，pH7.2～7.4；
液体深层发酵条件为：培养温度33℃～37℃，摇床转速160r/min～200r/min，培养时间为32～40h，检测纳豆激酶含...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘冬梅，蔡颖辉，杨传伦，王建平，李超孟，张心青，王秀芝，虞凤慧，杨丹丹，蔡倩倩，
申请(专利权)人：黄河三角洲京博化工研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37