鉴定临床样品中的革兰氏阳性致病生物或属于致病性革兰氏阳性菌预定组的成员的生物亚群的方法，包括 ａ）分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品， ｂ）使所述临床样品经过至少一次扩增和检测，包括 ｂａ）使用至少一组扩增引物进行的扩增步骤，所述扩增引物能够扩增来自所述革兰氏阳性致病性生物所属的致病性革兰氏阳性菌的预定亚组的预选核酸序列区， ｂｂ）使用至少一种杂交试剂进行的检测步骤，所述杂交试剂能够检测来自致病性革兰氏阳性菌的所述预定亚组的所述预选核酸序列区，其中所述检测步骤ｂｂ）包括步骤 ｂｂａ）监测预选温度下的杂交，所述杂交指示样品中存在包含于所述亚组中的至少一个物种，和 ｂｂｂ）监测杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示至少存在所述致病性革兰氏阳性菌或所述生物亚群中的物种， ｃ）根据ｂｂ）中监测步骤的结果鉴定所述生物或所述生物亚群。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测致病性微生物的
更具体而言，本专利技术涉及通过扩增并检测所述致病性革兰氏阳性菌的特定核酸序列而检测由临床样品中的致病性革兰氏阳性菌引起的感染的领域。
技术介绍
致病菌，特别是引起败血症的感染，大多发生且在医院的加强监护单元(ICU)中且较为严重。感染患者的细菌在绝大多数情况下是未知的且不能根据症状确定。每种细菌要求使用不同疗法，给予特定的抗生素。目前，在常规诊断中，致病菌，特别是革兰氏阳性菌是使用下列方法检测的该方法包括培养血液或其它体液样品从而使细菌(如果存在)生长。这类培养在有利于细菌生长的条件下维持约3天。在该时间内，细菌数增加，由此它们的核酸数也增加。之后，溶解培养基。将溶解混合物用作杂交反应的样品。整个方法最少花费约4天时间，直到清除任何样品的致病菌感染。致病菌感染对于受感染的人而言是非常严重的。在感染的第一天，必须开始治疗，优选给予适于影响特定感染细菌的抗生素。否则，人将受到严重感染且可能在感染清除前死亡。另一方面，若干抗生素的同时给药将阻止所有可能细菌的生长，从而不可避免地使患者虚弱。因此，该方法对于常规ICU诊断而言是不能令人满意的。长时间以来，使用特异性杂交探针、通过基于核酸的杂交来鉴定致病性生物如致病性细菌或真菌为本领域所知。例如，EP 0 131 052公开了方法和探针，其中特定物种或特定生物组的核糖体核糖核酸(rRNA)是从培养基直接检测的。核糖体靶序列的检测特别有效，这是由于这些序列是体内扩增，导致各测定法的高度灵敏性的事实。基于致病性生物检测的核酸序列的改进是根据PCR技术的有效性实现的。就致病性真菌，如假丝酵母和曲霉而言，例如，WO 97/07238公开了一种使用通用引物扩增所有类型的真菌核糖体18S rRNA序列，随后与真菌物种特异性探针杂交的方法。作为分析核糖体基因序列的选择性方法，非-编码但转录的核糖体间隔DNA序列，像位于16S和23S rRNA基因之间的ITS-1区已经用于检测和鉴定若干致病性生物(见，例如，EP 0 452 596)。在另一篇文章中，已通过可与等位基因特异性扩增方法相比较的靶-依赖性扩增区别了革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的组(Klausegger等人，Journal of Clinical Microbiology 33(1990)464-466)。根据它们的16S rDNA序列，Klausegger等人研究的物种的区别在于16S rRNA基因的规定位置不同，所有研究过的革兰氏阴性菌都在特定核苷酸位置包含G-残基，而所有研究过的革兰氏阳性菌都在所述核苷酸位置包含C-残基。随后，使用分别具有区别性的互补3’-末端C-残基或互补G-残基的适宜引物可导致革兰氏阳性或革兰氏阴性序列来源的DNA扩增。其它进展是在可进行动力学实时PCR的基础上做出的。在该类型的测定法中，在PCR的每个循环中监测PCR产物的形成。扩增通常是在热循环仪中测量的，该热循环仪还具有用于在扩增反应过程中监测荧光信号的其它检测工具。典型的例子是Roche DiagnosticsLightCyclerTM(Cat.No.20110468)。在LightCyclerTM以及迄今为止商业使用的其它实时PCR设备中，扩增产物是利用荧光标记的杂交探针检测的，它们仅在与靶核酸结合时发射荧光信号，或在某些情况下也利用结合双链DNA的荧光染料。测定所分析的所有反应的限定信号阈值并测定靶核酸以及参照核酸如标准或管家基因达到该阈值所需的循环次数(Cp)。靶分子的绝对或相对拷贝数可根据所获得的靶核酸及对照核酸的Cp值确定(Roche Diagnostics LightCyclerTM操作人员手册(Cat.No.2 0110468))。有不同的检测扩增DNA的方式a)DNA结合染料方式因为双链扩增产物的量通常多于最初存在于所分析样品中的核酸量，因此可使用双链DNA特异性染料，只要它们与双链DNA结合，用适宜波长激发后，即显示荧光增强。这种方法在EP 0 512 334中描述。优选地，仅使用那些染料，例如SYBRGreen I，其不会影响PCR反应的效率。本领域已知的所有其它方式要求适当设计荧光标记的杂交探针，其仅在与其靶核酸结合后发射荧光。b)TaqManTM探针用两种组分标记单链杂交探针。根据荧光共振能量转移的原理，当用适宜波长的光激发第一组分，即所谓的荧光剂时，吸收的能量转移到第二组分，即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤过程中，杂交探针结合靶DNA并在延伸阶段过程中，被聚合酶，例如Taq聚合酶的5’-3’-外切核酸酶活性降解。因此，将激发的荧光组分和猝灭剂彼此空间分开，由此即可测量第一组分的荧光发射(EP B 0 543 942和US 5,210,015)。c)分子信标还可用第一组分和猝灭剂标记这些杂交探针，所述标记优选位于至少部分自互补的探针的不同末端。由于探针的次级结构，两组分在溶液中空间邻近。与靶核酸杂交后，两组分彼此分开，这样在用适宜波长的光激发后，即可测量第一组分的荧光发射(US 5,118,801)。d)FRET杂交探针荧光共振能量转移(FRET)杂交探针试验方式特别用于所有种类的均质杂交测定法(Matthews，J.A.和Kr i cka，L.J.，Anal Biochem 169(1988)1-25)。它的特征在于两个单链杂交探针，它们同时使用且与(扩增)靶核酸相同链的相邻位点互补。用不同荧光组分标记两个探针。当用适宜波长的光激发时，按照荧光共振能量转移的原理，第一组分将吸收的能量转移至第二组分，这样一来，只有当两个杂交探针结合所检测靶分子的相邻位置时，才可测量第二组分的荧光发射。当退火于靶序列时，杂交探针的位置必须彼此非常接近，以头-尾方式排列。通常，第一探针的标记的3’末端与第二探针的标记的5’末端之间的间隔要尽可能的小，即1-5个碱基。这样使得FRET供体化合物与FRET受体化合物紧密邻近，通常为10-100埃。详细内容是熟知的且在，例如，EP0 070 687中公开。作为监测FRET受体组分的荧光增强的可选方法，还可监测FRET供体组分的荧光减弱，如杂交事件的定量测量。具体而言，FRET杂交探针方式可用于实时PCR，以便检测扩增的靶DNA。在实时PCR领域已知的所有检测方式中，FRET-杂交探针形式已被证实十分灵敏，准确且可靠(WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。然而，适宜的FRET杂交探针序列的设计有时可能受到所检测靶核酸序列的特殊特性的限制。作为使用两个FRET杂交探针的选择性方法，还可使用荧光-标记的引物和仅仅一个标记的寡核苷酸探针(Bernard，P.S.等人，Anal.Biochem.255(1998)101-7)。在这点上，可任意选择，无论是用FRET供体还是FRET受体化合物标记引物。FRET杂交探针(也称作FRET-Hybprobes或FRET探针)还可用于解链曲线分析(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。在这类测定法中，首先使用适宜的扩增引物在典型PCR反应中扩增靶核酸。杂交探针在扩增反应过程中已经存在或随后加入。PCR-反应完成后，样品温度显本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：G·哈伯豪森，T·埃姆里希，R·罗绍，G·延内斯，D·德沃斯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，基因创新有限公司，
类型：发明
国别省市：
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