一种大肠癌分子分期检测方法技术

本发明专利技术提供一种大肠癌分子分期检测方法，是利用人血清蛋白质指纹图谱，通过标本准备、数据收集、数据处理完成检测。本发明专利技术检测方法具有极高总准确率，其总准确率均达７５％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对大肠癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法与标准。本发明专利技术方法设计合理，可行，为前瞻性评价大肠癌分期，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划判断预后提供了可靠的依据。从而为降低我国大肠癌的病死率，提高大肠癌的治愈率提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及恶性肿瘤分子分期检测领域，为一种新的非侵入性的分期方法，对大肠癌进行缜密术前分期，对于指导新辅助治疗，明确手术范围及指征，并进行正确综合治疗及判断预后均具有重大意义。其总准确率均达到75.00％以上。
技术介绍
大肠癌在世界范围是第三大常见恶性肿瘤，在发达国家占第二位。近年来，我国大肠癌死亡率在大城市位居第四位，在农村位居第五位，并有逐年上升趋势。迄今为止大肠癌术前分期尚没有理想的方法，而术前准确地了解肿瘤侵犯范围对于临床医师选择手术方式和制定合理的综合治疗计划非常重要。过去50年来大肠癌根治术后生存率无明显变化，50％患者术后因局部复发或转移而最终死亡。死因与分期较晚和是否合理选择治疗方法有直接关联。大肠癌的治疗效果主要与病期有关，因此如何早期确诊并及早正确术前分期以指导治疗成为迫切要解决问题。迄今为止，大肠癌的标准治疗方法仍然是外科手术切除，术前对大肠癌侵犯程度的正确诊断直接影响其治疗方式的选择。今天术前分期被认为是前瞻性评价原发病灶范围，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划最关键的因素。目前，传统的非侵入性大肠癌的术前分子分期常有以下几种方法①X线造影和纤维内窥镜，虽然两者对消化道肿瘤粘膜表面，粘膜下或粘膜自身病变具有良好显示能力，但都难以了解癌肿腔外浸润程度、与临近器官关系、区域淋巴结转移情况，均不能对结直肠癌进行术前分期。②螺旋CT，螺旋CT对于术前早期病变T1-T3分期还有一定限度；N分期较困难，必须综合其大小、形态、密度及其生物学行为进行全面的判断。周纯武等报道探讨螺旋CT(SCT)对结、直肠癌术前分期的价值，总的分期准确率为58.1％(18/31)。判断T分期的准确率为84.4％(27/32)，N分期的准确率为61.3％(19/31)。③磁共振、腔内B超对确定大肠癌有无淋巴结转移意义不可靠，因为它们均难发现小的淋巴结，而有癌转移的淋巴结78％直径≤5mm。它们可发现直径10-15mm以上的淋巴结，但大的淋巴结不一定是转移的。③直肠指检可扪及至少距肛门7cm以内直肠壁，但也不能评估淋巴结转移。③血液中肿瘤标记物的检测，癌胚抗原(CEA)、血清糖链抗原199(CA199)、血清糖链抗原242(CA242)等肿瘤标志物，不具有特异性诊断价值，只对估计预后和术后复发有一定帮助，对于分期则没有帮助。表面-增强激光解吸-电离(SELDI)其基本原理是通过特定的化学表面结合蛋白质分子再以激光轰击，使蛋白质成为离子而飞行于电场中并被检测器所测得，进而用不同位置、强度的峰来表示各种不同的蛋白质及其相对含量，最终形成可用于分析的图谱，是最近几年才发展起来的一种新的蛋白组学的研究方法。SELDI可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片阵列结合，就可通过电离-解吸飞行时间-质谱仪检测，并根据蛋白质的质量和电荷比(m/z)每一个蛋白质的峰值明显地分离并形成一个蛋白质(保留在芯片上的蛋白质)的图谱。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种大肠癌分子分期的检测方法，由此方法建立的该指纹图谱模型为大肠癌术前分子分期提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。本专利技术方法通过以下步骤实现1.标本准备将待测血清标本冰浴中解冻，10000r/min离心5min，取5μL与10μLU9处理液(9mol/L尿素、0.2％CHAPS，0.1％DTT)混合振荡处理30min后，加50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)185μL混匀，CM10芯片(弱阳离子交换蛋白芯片)置于96孔支架中，50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)平衡芯片5min×2次，取经过处理、稀释的血清100μL加至芯片上，4℃摇床反应1h，反应结束甩干芯片表面液体，依次以50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝4.0)清洗芯片5min×3次；去离子水快速清洗2次，芯片自然干燥后点加1μL能量吸收基质(SPA)两次，待干燥后行质谱仪检测。2.数据收集应用PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、SPA收集血清蛋白质质谱数据，激光强度165，检测灵敏度7，数据收集范围2000～30000m/z。3、数据处理及检测依据由六个蛋白质峰组合的模型检测局限性大肠癌和区域性大肠癌；依据由三个蛋白质峰组合的模型检测局限区域性大肠癌和系统性大肠癌；依据由三个蛋白质峰组合的模型检测I期和II期大肠癌；依据由两个蛋白质峰组合的模型检测I期和III期大肠癌；依据由三个蛋白质峰组合的模型检测II期和III期大肠癌；依据由四个蛋白质峰组合的模型检测II期和IV期大肠癌；依据由两个蛋白质峰组合的模型检测III期和IV期大肠癌。按国际抗癌联盟(the International Union Against Cancer，UICC)1997TNM(Ttumor原发肿瘤，Nnode淋巴结转移，Mmetastasis远处转移)分期标准将大肠癌分为I，II，III，IV期，应用生物信息学分析方法检测大肠癌分子分期。原始数据先以蛋白芯片(Proteinchip Software)3.0软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，曼-惠特尼秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。生物信息学分析方法是指应用支持向量机、判别分析和时间序列分析软件进行大肠癌分子分期的检测。本防主要仪器、软件及试剂PBS-II表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、能量吸收基质(SPA芥子酸)、CM10型蛋白质芯片及相应分析软件ProteinChip Software 3.0(美国Ciphergen公司)；支持向量机(support vector machines，SVM)、判别分析(discriminant analysis)和时间序列分析(time-sequence analysis)软件、Matlab6.5数据处理软件(MathWorks公司)；分析纯尿素、乙酸钠、乙腈、DTT和CHAPS缓冲盐(Sigma公司)。本专利技术与其他非侵入性大肠癌的诊断方法比较具有以下优点(1)本专利技术提供的指纹图谱，为大肠癌术前分子分期提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。(2)与以往的传统的非侵入性方法比较具有极高总准确率，其总准确率均达75％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对大肠癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法与标准。(3)本专利技术模型的构建方法设计合理，可行，为前瞻性评价大肠癌分期，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划判断预后提供了可靠的依据。从而为降低我国大肠癌的病死率，提高大肠癌的治愈率提供了一种新的方法。附图说明图1不同TNM分期二维散点分布图。图2为质荷比(M/Z)位于2759.58Da(A)，2964.66Da(B)，2048.01Da(C)，4795.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠癌分子分期检测方法，利用人血清蛋白质指纹图谱，其特征是通过以下步骤实现：（１）标本准备：采用由９ｍｏｌ／Ｌ尿素、０．２％ＣＨＡＰＳ，０．１％ＤＴＴ混合的处理液处理血清标本，采用弱阳离子交换蛋白芯片ＣＭ１０、ｐＨ＝４．０的乙酸 钠溶液平衡芯片，取上述处理、稀释的血清加至芯片上再以ｐＨ＝４．０的乙酸钠溶液、去离子水清洗芯片，干燥。（２）数据收集：应用ＰＢＳ－Ⅱ表面加强激光解吸电离－飞行时间质谱仪收集血清蛋白质质谱数据，激光强度１６５，检测灵敏度７，数据收集范 围２０００～３００００ｍ／ｚ。（３）数据处理及检测：依据由六个质荷比位于２７５９．５８、２９６４．６６、２０４８．０１、４７９５．９０、４１３９．７７和３７７６１．６的蛋白质峰组合的模型检测局限性大肠癌和区域性大肠癌，依据由三个质荷 比位于６８８５．３０、２０５８．３２和８５６７．７５的蛋白质峰组合的模型检测局限区域性大肠癌和系统性大肠癌，依据由三个质荷比位于３３７６．２９、４２８５．２１和１３７６２．６的蛋白质峰组合的模型检测Ⅰ期和Ⅱ期大肠癌，依据由两个质荷比位于２７５９．５８和２９６４．６６的蛋白质峰组合的模型检测Ⅰ期和Ⅲ期大肠癌，依据由三个质荷比位于４１３９．７７、２２９２．３１和２７５９．５８的蛋白质峰组合的模型检测Ⅱ期和Ⅲ期大肠癌，依据由四个质荷比位于２９５４．６５、４７９５．９０、２１７４．４４和２８９０．４７的蛋白质峰组合的模型检测Ⅱ期和Ⅳ期大肠癌，依据由两个质荷比位于６６３４．６７和２０２２．５５的蛋白质峰组合的模型检测Ⅲ期和Ⅳ期大肠癌，应用生物信息学分析方法检测大肠癌分子分期。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文鸿，陈益定，张苏展，胡跃，余捷凯，郑树，胡汛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]