用于大肠杆菌与志贺菌甄别的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了用于大肠杆菌和志贺菌甄别的试剂盒，涉及基于质谱的病原体甄别检测技术领域。本发明专利技术将生化方法和质谱技术相结合，根据大肠杆菌、志贺菌各自的生化特性，确定两个特征蛋白的质荷比

【技术实现步骤摘要】
用于大肠杆菌与志贺菌甄别的试剂盒
本专利技术涉及蛋白质谱检测
，具体地，涉及用于甄别大肠杆菌和志贺菌并鉴定宋内志贺菌的试剂盒。
技术介绍
致病性大肠杆菌共包括5类，分别为肠出血性大肠杆菌（EHEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）和凝聚性大肠杆菌（EAEC）。志贺菌根据生化反应和O抗原不同，分为4个血清群，即痢疾志贺菌（A群）、福氏志贺菌（B群）、鲍氏志贺菌（C群）、宋内志贺菌（D群）。大肠杆菌与志贺菌有密切的亲缘关系，在遗传学上非常接近、遗传信息相似，因此，区分大肠杆菌与志贺菌以及志贺菌的四个种群非常困难，但意义重大。从传染病防治法的角度，大肠杆菌引起的腹泻属于丙类中的其他感染性腹泻病，而志贺菌引起的细菌性痢疾属于乙类传染病，报告和处理要求均不相同。因此大肠杆菌与志贺菌的甄别鉴定十分重要，快速、准确的区分甄别意义重大。宋内志贺菌和福氏志贺菌是我国分离株的主要菌群，我国6年内的志贺菌分离株中，宋内志贺菌与福氏志贺菌的分离率为92.3%，这两个种群的快速区分，对我国志贺菌病的诊断与防治具有重要意义。大肠杆菌与志贺菌区分鉴定主要依靠传统的系统生化方法，志贺菌采用血清学进行种群的区分。目前，全基因组测序技术、16SrRNA等分子生物学方法也用于大肠杆菌与志贺菌的区分以及志贺菌各个血清群的甄别鉴定。全球范围内高端技术体系的发展为细菌识别鉴定提供了有利的工具。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术已经发展近10余年，在微生物识别鉴定领域的应用已趋于成熟，其快速、准确、易操作、廉价、高通量的特点已得到全世界范围的认同。但直接采用商业化的MALDI-TOFMS技术无法区分大肠杆菌与志贺菌是业内公知的常识，研究者采用在商业化系统数据库内大量增加标准参考菌谱的方式、采用MALDI-TOFMS结合ClinProTools软件的方式以及MALDI-TOFMS结合人工神经网络分析的方法进行大肠杆菌与志贺氏菌的区分，识别能力较原商业化系统有所提高，达到90-94%的区分能力。但这些方法还是基于菌株本身的核糖体蛋白，采用的与商业化系统相同的样本处理方式，只是在分析方法上进行的改进。志贺氏菌种内仍无法用MALDI-TOFMS区分。也有研究者通过宋内志贺的四个特征蛋白峰（5612.81±8.7、4871.12±45.9、4164.03±26、3247.05±6.9）来区分宋内志贺和大肠杆菌，该方法采用24株宋内志贺菌，采集了480张图，构建了标准参考谱，并将标准参考谱中与大肠杆菌的标准谱相比较得到的四个特异峰作为两者鉴定判别的标准。然而采用该方法存在两个问题，一是该方法是基于宋内志贺菌本身的核糖体蛋白采用MALDI-TOFMS的常规手段进行手动操作进行区分，工作量繁琐且复杂，采用现行的MALDI-TOFMS结合ClinProTools软件方法完全可以更高效地筛选获得宋内志贺的特征蛋白峰，并替代该技术，且对宋内志贺菌核糖体蛋白筛选的覆盖面更广，另一个问题是，特征蛋白峰以5612.81±8.7等来表征，这种表征方式在本领域内是不正确的，例如5612.81是质荷比峰值，8.7是信噪比，两个不同的单位数值进行加减是不合理的，且由于信噪比不是定值，每一张谱图都不完全相同，不能将质荷比（质量的大小）加减信噪比（信号强度的比值）；用这四个蛋白也无法区分宋内志贺和大肠杆菌，更无从谈及志贺菌种群的区分。针对大肠杆菌与志贺菌的区分鉴定、志贺菌种群的区分鉴定，目前采用传统的生化方法及血清学分方法，操作复杂、耗时长、成本高。基于MALDI-TOFMS的大肠杆菌与志贺菌鉴定结果混淆不清，文章中发表的改进的技术方法也只能达到最高94%的甄别能力；基于MALDI-TOFMS技术无法进行志贺菌种群的区分鉴定，特别是容易将志贺菌误检为大肠杆菌，从而导致用MALDI-TOFMS技术无法将大肠杆菌与志贺菌准确区分，更无法进一步鉴定志贺菌是否为宋内志贺菌，给食品安全检验、传染病病原鉴定和传染病的防治防控工作带来了不便和误诊风险。因此，当一个未知菌通过MALDI-TOF质谱鉴定得出鉴定结果是大肠杆菌或志贺菌或大肠杆菌+志贺菌时，目前的MALDI-TOF质谱方法无法进一步区分大肠杆菌和志贺菌，更无法精确鉴定到是否为宋内志贺菌，迫切需要一种高通量、准确、操作简便的针对大肠杆菌与志贺菌、以及志贺菌我国分离株的型别区分方法，以开发我国自主知识产权的质谱甄别技术，为传染病防控提供新型技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于MALDI-TOFMS技术的，快速、灵敏、准确、高通量的甄别大肠杆菌和志贺菌以及确定是否为宋内志贺的方法。本专利技术从微生物生化特性方面着手，考察大肠杆菌与志贺菌的生化特性差异，发现在生化特性方面，大肠杆菌、志贺菌在生长过程中会分泌多种生物酶，本专利技术经过仔细梳理、甄别和筛选，发现所有类型的大肠杆菌在生长过程中都产赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶，A、B、C、D四个群的志贺菌在生长过程中只有宋内志贺产鸟氨酸脱羧酶（不产赖氨酸脱羧酶），其他三种群的志贺菌既不产赖氨酸脱羧酶也不产鸟氨酸脱羧酶。赖氨酸脱羧酶将赖氨酸分解为尸胺和二氧化碳、鸟氨酸脱羧酶可将鸟氨酸分解为腐胺和二氧化碳。基于申请人的上述分析和归纳，对于已知待测菌属于大肠杆菌或志贺菌，要想进一步确定是大肠杆菌还是志贺菌，只要检测待测菌带电尸胺特征峰m/z103.12±0.1,无论是否有特征峰m/z89.10±0.1，就可以确定待测菌是大肠杆菌（包括所有型别）；若没有检测到m/z103.12±0.1，则待测菌可以确定是志贺菌，因此，将带电尸胺103.12±0.1确定为大肠杆菌和志贺菌甄别的特征峰。申请人进一步发现，若检测结果特征峰没有m/z103.12±0.1，且检测到了特征峰m/z89.10±0.1,说明该菌只产鸟氨酸脱羧酶，即可判定为宋内志贺菌，因此，将带电腐胺m/z89.10±0.1确定为宋内志贺菌甄别特征峰。本专利技术根据大肠杆菌与志贺菌的生化特性，即大肠杆菌产赖氨酸脱羧酶及鸟氨酸脱羧酶，宋内志贺菌仅产鸟氨酸脱羧酶，确定赖氨酸和鸟氨酸的相应脱羧峰特征峰分别为带电尸胺m/z103.12±0.1（尸胺的摩尔质量为103.19，质谱检测到的精确分子量为103.12，由于不同设备采集数据存在误差，故本专利技术限定带电尸胺m/z为103.12±0.1）、带电腐胺m/z89.10±0.1（腐胺的摩尔质量为89.16,质谱检测到的精确分子量为89.10，由于不同设备采集数据存在误差，故本专利技术限定带电腐胺m/z为89.10±0.1），通过MALDI-TOFMS检测这两个特征峰判断待检测的样本是大肠杆菌还是志贺菌，并进一步确定是否为宋内志贺菌。第一方面，本专利技术首先提供了一种甄别大肠杆菌和志贺菌的特征蛋白，所述特征蛋白组合为带电尸胺，所述带电尸胺的特征峰质荷比m/z为：103.12±0.1。本专利技术提供了上述特征蛋白在构建甄别大肠杆菌和志贺菌试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种从志贺菌或大肠杆菌中鉴定宋内志贺菌的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甄别大肠杆菌和志贺菌的特征蛋白，其特征在于，所述特征蛋白组合为带电尸胺，所述带电尸胺的特征峰质荷比

【技术特征摘要】
1.一种甄别大肠杆菌和志贺菌的特征蛋白，其特征在于，所述特征蛋白组合为带电尸胺，所述带电尸胺的特征峰质荷比m/z为：103.12±0.1。


2.权利要求1所述的特征蛋白在构建甄别大肠杆菌和志贺菌试剂盒中的应用。


3.一种从志贺菌中或大肠杆菌中鉴定宋内志贺菌的特征蛋白组合，其特征在于，所述特征蛋白组合为带电尸胺和带电腐胺，所述带电尸胺和带电腐胺的特征峰质荷比m/z分别为：103.12±0.1、89.10±0.1。


4.权利要求3所述的特征蛋白组合在构建甄别大肠杆菌、志贺菌及宋内志贺菌试剂盒中的应用。


5.一种甄别大肠杆菌和志贺菌以及鉴定宋内志贺菌的试剂盒，其特征在于，含有生化试剂、反应液、标准校正液，所述生化试剂中含有赖氨酸和鸟氨酸，二者质量比为1:1-5；所述反应液为5-10mg/L磷酸吡哆醛的PBS溶液；
所述试剂盒基于MALDI-TOFMS对待测细菌进行检测，检测结果以待测细菌是否具有权利要求1所述的特征蛋白或权利要求3所述的特征蛋白组合来判断，带电尸胺的特征峰质荷比m/z为103.12±0.1或带电腐胺特征峰质荷比m/z为89.10±0.1作为判断标准；所述待测细菌为已知属于大肠杆菌或志贺菌，但不确定具体种属。


6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当检测到待测细菌具有带电尸胺特征峰m/z103.12±0.1时，待测细菌为大肠杆菌；
当没有检测到带电尸胺特征峰m/z103.12±0.1，待测细菌为志贺菌；
当没有检测到带电尸胺特征峰m/z103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z89.10±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌；
当没有检测到带电尸胺特征峰m/z103.12±0.1，也没有检测到带电腐胺特征峰m/z89.10±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌的A群、B群或C群。


7.一种大肠杆菌和志贺菌的非疾病诊断目的的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待测菌接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育；所述待测菌为已知属于大肠杆菌或志贺菌，但不确定是大肠杆菌还是志贺菌；
（2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖迪，李天一，金东，张炳华，熊衍文，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11