牡丹EST-SSR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术涉及牡丹EST‑SSR引物组及其应用，属于基因工程技术领域，本发明专利技术从牡丹转录组EST‑SSR标记开发与引物筛选角度，筛选得到扩增稳定、多态性高的20对引物，采用所述20对引物，可对牡丹品种进行亲缘关系分析，为后续学者筛选更多的牡丹SSR位点提供了思路，为开展牡丹种质资源管理，遗传保护及选育、分析牡丹的遗传多样性等奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
牡丹EST-SSR引物组及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及牡丹EST-SSR引物组及其应用。
技术介绍
牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)隶属于芍药科、芍药属，为多年生落叶灌木。因品种繁多，花冠硕大，花姿优美，色泽鲜艳，色味芳香，富丽堂皇，雍容华贵，具有很大的欣赏价值，深受各族人民的喜爱。SSR(SimpleSequenceRepeats)标记又称微卫星DNA，由几个核苷酸(一般为1～6个)的重复单位组成，总的串联重复序列可长达几十个核苷酸。SSR标记具有高度重复性与可靠性、丰富的多态性、共显性等优点。在微卫星位点克隆和测序分析方面，传统的SSR分子标记费时、费力和代价昂贵，一般很难实现的，因此限制了它的广泛应用。从目前来看，伴随测序技术的发展，公共数据库中来源于不同物种的基因表达序列(expressedsequencetag，EST)的数目在快速增长。这些EST序列不仅在新基因发掘方面占有一席之地，而且为SSR标记开发提供了一个巨大的、有价值的来源，这种基于EST序列开发的SSR称为EST-SSR标记。高通量测序技术的发展，为分子标记技术的迅速发展提供了有利条件，目前EST-SSR标记已被应用于性状定位，植物分类，品种鉴定，系统进化，遗传多样性分析，比较基因组学方面，使得转录组EST-SSR标记开发在腊梅，杉木，棉花，文冠果，双须骨舌鱼，红松等植物种属中均有开发应用。牡丹作为一种备受瞩目的植物，对其的研究也受到了各界学者的青睐，寻找适用于牡丹品种相关遗传学研究的引物，是进一步开展牡丹种质资源管理、遗传保护等研究的前提基础。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的一在于提供牡丹EST-SSR引物组，目的二在于提供所述引物组在牡丹品种遗传分析中的应用。本专利技术所提供的筛选引物扩增稳定，多态性高。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：牡丹EST-SSR引物组，所述引物组包括20对引物，分别为如SEQIDNO：1～2的PS002、如SEQIDNO：3～4的PS019、如SEQIDNO：5～6的PS021、如SEQIDNO：7～8的PS030、如SEQIDNO：9～10的PS031、如SEQIDNO：11～12的PS034、如SEQIDNO：13～14的PS038、如SEQIDNO：15～16的PS042、如SEQIDNO：17～18的PS046、如SEQIDNO：19～20的PS057、如SEQIDNO：21～22的PS061、如SEQIDNO：23～24的PS062、如SEQIDNO：25～26的PS070、如SEQIDNO：27～28的PS071、如SEQIDNO：29～30的PS074、如SEQIDNO：31～32的PS075、如SEQIDNO：33～34的PS085、如SEQIDNO：35～36的PS086、如SEQIDNO：37～38的PS092和如SEQIDNO：39～40的PS096。本专利技术还请求保护所述引物组在牡丹品种亲缘关系分析中的应用。进一步地，所述应用是指利用所述引物组进行牡丹品种的亲缘关系分析，所述分析方法包括以下步骤：(1)、提取待分析牡丹样本的基因组DNA；(2)分别采用所述20对引物对步骤(1)提取的基因组DNA进行扩增并进行凝胶电泳分析；(3)通过牡丹样本的聚类树状图进行亲缘关系分析。更进一步地，所述牡丹的品种包括：满江红、李园红、花王、乌龙捧盛、晨红、冠世墨玉、奇花献影、世世之誉、满堂红、春红娇艳、夜光杯、烟绒紫、徽紫、川后同丹、魏紫、雪峰、墨池手辉、杏花春雨、三变赛玉和宝康紫玟玉。有益效果：本专利技术从牡丹转录组EST-SSR标记开发与引物筛选角度，筛选得到扩增稳定、多态性高的20对引物，采用所述20对引物，可对牡丹品种进行亲缘关系分析，为后续学者筛选更多的牡丹SSR位点提供了思路，为开展牡丹种质资源管理，遗传保护及选育、分析牡丹的遗传多样性等奠定基础。附图说明图1是不同串联重复单元类型的SSR在总SSR中所占比例的统计图；图2～21是分别采用引物PS002、PS019、PS021、PS030、PS031、PS034、PS038、PS042、PS046、PS057、PS061、PS062、PS070、PS071、PS074、PS075、PS085、PS086、PS092和PS096扩增20种牡丹DNA的SSR凝胶电泳图；图22是20种牡丹样本的聚类树状图；图2～22中1～20号牡丹样本分别为：1：满江红；2：李园红；3：花王；4：乌龙捧盛；5：晨红；6：冠世墨玉；7：奇花献影；8：世世之誉；9：满堂红；10：春红娇艳；11：夜光杯；12：烟绒紫；13：徽紫；14：川后同丹；15：魏紫；16：雪峰；17：墨池手辉；18：杏花春雨；19：三变赛玉；20：宝康紫玟玉。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例11、供试材料与试剂供试植物材料：本研究植物材料采用洛阳市20个牡丹品种：满江红，李园红，花王，乌龙捧盛，晨红，冠世墨玉，奇花献影，世世之誉，满堂红，春红娇艳，夜光杯，烟绒紫，徽紫，川后同丹，魏紫，雪峰，墨池手辉，杏花春雨，三变赛玉，宝康紫玟玉。并对20种牡丹品种从1～20依次进行编号。20种牡丹品种的幼嫩叶片随机取自洛阳牡丹研究院，进行干燥处理后，保存于自封袋备用。主要设备与仪器：YXQ-SG46-280S型手提式压力蒸汽灭菌器；101-1AB型电热鼓风干燥箱；SCIENTZ-48型高通量组织研磨器；JA2003A型电子天平；D3024R型离心机(SCILOGEX)；超微量分光光度计(K5500)；DYY-6C型电泳仪；WD-9406型胶片观察灯；振荡器；SEDIG型梯度PCR仪；EppendorfAG型PCR仪。主要试剂：1mol/L的Tris-HCl(PH＝8.0)溶液；0.5mol/LEDTA(PH＝8.0)溶液；CTAB溶液；10×TBE溶液；TEbuffer溶液；10％的过硫酸铵；10％聚丙烯酰胺凝胶工作液；染色液；显影液。2实验方法2.1牡丹DNA的提取及纯化本试验按照改良的CTAB磁珠法提取牡丹叶片的基因组DNA。称取20种牡丹样本的干燥叶片35mg分别置于不同的2ml研磨管中，并放入直径3mm的小钢珠一枚进行研磨。CTAB溶液65℃水浴锅中预热，异戊醇4℃预冷。研磨后的样品粉末加入700μL预热的CTAB溶液，震荡混匀。水浴锅预热30min后，加入700μL的氯仿：异戊醇(24:1,V/V)溶液，12000r/min离心5min。吸取上清液并加入100μL3M的NaAC溶液和2倍体积的-20℃低温预冷的无水乙醇，-20℃条件静置0.5h；12000r/min离心3min后弃去上清液，保留沉淀。加入50uL75％的乙醇，清洗提取的DNA2次，倒掉溶液，常温干燥DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牡丹EST-SSR引物组，其特征在于：所述引物组包括20对引物，分别为如SEQ ID NO：1~2的PS002、如SEQ ID NO：3~4的PS019、如SEQ ID NO：5~6的PS021、如SEQ ID NO：7~8的PS030、如SEQ ID NO：9~10的PS031、如SEQ ID NO：11~12的PS034、如SEQ ID NO：13~14的PS038、如SEQ ID NO：15~16的PS042、如SEQ ID NO：17~18的PS046、如SEQ ID NO：19~20的PS057、如SEQ ID NO：21~22的PS061、如SEQ ID NO：23~24的PS062、如SEQ ID NO：25~26的PS070、如SEQ ID NO：27~28的PS071、如SEQ ID NO：29~30的PS074、如SEQ ID NO：31~32的PS075、如SEQ ID NO：33~34的PS085、如SEQ ID NO：35~36的PS086、如SEQ ID NO：37~38的PS092和如SEQ ID NO：39~40的PS096。/n

【技术特征摘要】
1.牡丹EST-SSR引物组，其特征在于：所述引物组包括20对引物，分别为如SEQIDNO：1~2的PS002、如SEQIDNO：3~4的PS019、如SEQIDNO：5~6的PS021、如SEQIDNO：7~8的PS030、如SEQIDNO：9~10的PS031、如SEQIDNO：11~12的PS034、如SEQIDNO：13~14的PS038、如SEQIDNO：15~16的PS042、如SEQIDNO：17~18的PS046、如SEQIDNO：19~20的PS057、如SEQIDNO：21~22的PS061、如SEQIDNO：23~24的PS062、如SEQIDNO：25~26的PS070、如SEQIDNO：27~28的PS071、如SEQIDNO：29~30的PS074、如SEQIDNO：31~32的PS075、如SEQIDNO：33~34的PS085、如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：程彦伟，周晓君，张延召，郭明欣，李会云，
申请(专利权)人：洛阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41